Ocorrente e recombinante, empregando

7 
2.   REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
 
 
 
 
 
 
 
7 
2.1. A ERA DOS BIOCOMBUSTÍVEIS 
8 
2.2. ETANOL: O PRINCIPAL BIOCOMBUSTÍVEL
 
9 
                                  2.2.1. PANORAMA MUNDIAL 
9 
 
                     2.3.2. PANORAMA NACIONAL 
10 
2.3. CANA-DE-AÇÚCAR: A MATÉRIA-PRIMA BRASILEIRA PARA 
PRODUÇÃO DE ETANOL
 
12 
                                  2.3.1.
 
PRODUÇÃO DE AÇÚCAR E ETANOL DO CALDO DE CANA     
13 
 
                     2.3.2. BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR   
15 
2.4. MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS
 
16 
2.4.1.
 MATÉRIA-PRIMA PARA A PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS
 
16 
                                  2.4.1. ESTRUTURA CELULAR    
18 
 
                     2.4.2. CONSTITUIÇÃO QUÍMICA 
20 
2.4.2.1. Celulose 
21 
2.4.2.2. Hemicelulose 
23 
2.4.2.3. Lignina 
24 
2.5. PRÉ-TRATAMENTO DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS
 
 
26 
2.5.1. PRETRATAMENTO ÁCIDO   
 
 
 
27 
2.5.2. PRETRATAMENTO ALCALINO  
 
 
 
 
28 
2.5.3. INIBIDORES 
29 
                                 2.5.4. PRÉ- HIDRÓLISE ENZIMÁTICA  
 
 
 
 
30 
2.6. A BACTÉRIA Zymomonas mobilis 
 
 
 
 
 
31 
                                 2.6.1. BREVE HISTÓRICO  
 
 
 
 
31 
                                  2.6.2. CARACTERÍSTICAS GERAIS  
 
 
 
 
33 
2.6.2.1. Biologia molecular básica de Z. mobilis  
34 
                               2.6.3. CARACTERÍSTICAS CULTURAIS  
35 
2.6.3.1. Z. mobilis X S. cerevisiae 
35 
2.6.3.2. Outras Habilidades  
 
 
36 
2.6.4.  UTILIZAÇÃO DE AÇÚCARES 
37 
2.6.5. ROTA METABÓLICA 
 
 
 
38 
                                 2.6.6. FORMAÇÃO DE SUBPRODUTOS   
 
 
39 
                            2.6.7. MEIOS DE CULTIVO  
 
 
 
 
 
40 
2.6.7.1. Nitrogênio 
41
 
2.6.7.2. Fósforo 
43
 
2.6.7.3. Enxofre 
43 
2.6.7.4. Meios de cultivo de baixo custo   
43 
                                  2.6.9. PRODUÇÃO DE ETANOL CONVENCIONAL POR Z. mobilis 
45 
2.6.9.1. Inibição pelo produto, substrato e temperatura 
47 
2.7. ESTRATÉGIAS DE PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE ETANOL DE 
SEGUNDA GERAÇÃO
 
 
 
 
 
 
50 
2.7.1. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA SEPARADA DA FERMENTAÇÃO  
50 
2.7.2. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEAS 
51 
3.7.3. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E CO-FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEAS 
52 
2.7.4. BIOPROCESSO CONSOLIDADO  
53 
2.7.5. PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO POR  
Z. mobilis 
54 

 
xiii 
2.8. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DE PENTOSES POR 
LINHAGENS RECOMBINANTES DE Zymomonas mobilis
 
56 
2.8.1.  METABOLIZAÇÃO DA XILOSE 
56 
2.8.1.1. Breve Histórico 
58 
2.8.2. METABOLIZAÇÃO DA ARABINOSE 
60 
2.8.3. PROBLEMÁTICAS 
64 
  2.8.3.1. Estabilidade 
 
 
 
64 
  2.8.3.2. Proteína Transportadora   
 
65 
2.8.3.3. Xilose X Glicose 
66 
2.8.3.4. Atividades Enzimáticas 
68 
2.8.3.5. Produção de Xilitol 
69 
2.8.3.6. Inibição pelo Substrato/ Produto 
70 
2.8.3.7. Inibição por Compostos Tóxicos 
70 
2.8.4. ALTERNATIVAS 
72 
2.8.4.1. Linhagens adaptadas à toxicidade 
72 
2.8.4.2. Redução de cargas enzimáticas no processo 
SSCF 
73 
2.8.4.3. Modificação genética da glf 
74 
2.8.4.4. Inativação da GFOR 
74 
2.8.4.5. Adaptação Metabólica 
74 
2.8.4.6. Integração Cromossomal 
75 
2.8.5. TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA PARA DIFERENTES 
FINALIDADES 
75 
2.9. CONSIDERAÇÕES GERAIS
  
77 
 
 
CAPÍTULO 3 
 
79 
3. 
JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS
 
79 
3.1. JUSTIFICATIVAS
 
79 
3.2. OBJETIVO GERAL
 
81 
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
81 
 
 
CAPÍTULO 4 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
83 
4. MATERIAIS E MÉTODOS  
 
 
 
 
 
 
 
84 
4.1. MATÉRIA-PRIMA  
 
 
 
 
 
 
 
84 
4.1.1. BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR 
84 
4.1.2. RESÍDUO DA INDÚSTRIA DE CELULOSE 
84 
4.2. PRÉ-TRATAMENTO DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
  
 
84 
4.2.1. PRÉ-TRATAMENTO ÁCIDO  
84 
4.2.2. PRÉ-TRATAMENTO ALCALINO 
 
86 
4.2.3. PRÉ-HIDRÓLISE ENZIMÁTICA  
 
 
 
 
87 
4.3. A BACTÉRIA Zymomonas mobilis NATIVA 
87 
4.3.1. MANUTENÇÃO DAS CULTURAS DE Z.mobilis  
 
 
88 
4.3.2. PRÉ- INÓCULO E INÓCULO: COMPOSIÇÃO DE MEIO E 
CONDIÇÕES DE CULTIVO   
 
 
 
89 
4.3.1. ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO 
90 
4.3.3.1.  Desempenho das linhagens nativas frente à 
utilização de glicose e xilose 
91 
4.3.3.2.  Produção de etanol a partir do bagaço de 
cana e resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis 
nativa através do processo SSF 
91 
I. Otimização da produção de etanol a partir de 
bagaço de cana e PM2 por Z. mobilis CP4 nativa 
92 
II.  Análise da adição de diferentes componentes do 
meio no hidrolisado celulósico do bagaço de cana e 
PM2 frente à produção de etanol a partir por Z. 
mobilis CP4 nativa 
93 

 
xiv 
4.4. LINHAGEM RECOMBINANTE DE Zymomonas mobilis 
95 
4.4.1. APLICAÇÃO DA ENGENHARIA GENÉTICA EM Z. mobilis  
95 
4.4.1.1. Desenho dos genes 
95 
4.4.1.2. Amplificação gênica em E. coli 
96 
4.4.1.3. Extração do DNA 
96 
4.4.1.4. Transformação em Zymomonas mobilis 
97 
I.  Células competentes de Z. mobilis 
97 
II.  Plasmídeo exógeno 
98 
III. Eletroporação 
98 
4.4.1.4. Etapa pós-transformação 
98 
4.4.1.5. Meio de crescimento e manutenção 
99 
4.4.2.
 
ENSAIOS
 
DE
 
FERMENTAÇÃO 
100 
4.4.2.1. Ensaios preliminares para avaliar o consumo de 
glicose e xilose em meio sintético por Z. mobilis 
geneticamente modificada 
100 
I.  Seleção de clones 
101 
I.  Adaptação metabólica 
101 
4.4.2.2. Ensaios para produção de etanol a partir de 
bagaço de cana através do processo SSCF 
102 
I.  Adaptação metabólica 
102 
II.  Processo de propagação mediante 
diferentes estratégias de aclimatação 
celular 
103 
III.  Avaliação da produção de etanol a partir do 
processo SSCF através de planejamentos 
experimentais sequenciais 
104 
4.5. PRODUÇÃO DE ETANOL EM BIORREATOR INSTRUMENTADO 
ATRAVÉS DOS PROCESSOS SSF E SSCF 
105 
4.6. MÉTODOS ANALÍTICOS 
 
 
 
 
 
  106 
4.6.1. DETERMINAÇÃO DE ETANOL E AÇÚCARES POR CLAE 
1  106 
4.6.2. QUANTIFICAÇÃO DO MICRORGANISMO 
1  107 
4.7. ANÁLISE DOS RESULTADOS 
1  107 
4.7.1. ESTATÍSTICA  
107 
4.7.2. CÁLCULO DE EFICIÊNCIA  
108 
4.7.3. TAXA INSTANTÂNEA ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO  
  108 
4.7.4. TEMPO DE DUPLICAÇÃO 
  109 
4.7.5. VARIÁVEIS DE RESPOSTA 
  109 
 
 
CAPÍTULO 5  
 
 
 
110 
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES  
 
 
 
 
 
 
110 
5.1.   ENSAIOS  DE  FERMENTAÇÃO  EMPREGANDO  A  BACTÉRIA 
Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE 
111 
5.1.1.  DESEMPENHO  DAS  LINHAGENS  NATIVAS  FRENTE  À 
UTILIZAÇÃO DE GLICOSE E XILOSE 
111 
5.1.2.  OTIMIZAÇÃO  DO  PROCESSO  DE  HIDRÓLISE  ENZIMÁTICA 
SIMULTÂNEA  À  FERMENTAÇÃO  ALCOÓLICA  POR  Zymomonas 
mobilis CP4 
114 
I.  Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado 
114 
II.  Resíduos da indústria de celulose 
126 
5.1.3.  ANÁLISE DA ADIÇÃO DE DIFERENTES COMPONENTES DO 
MEIO NO PROCESSO FRENTE À PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR 
POR Z. mobilis CP4 NATIVA 
130 
I. Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado 
130 
Delineamento fatorial 
130 
Planejamento Composto Central Rotacional  
134 
II.  Resíduo da indústria de celulose  
139 
5.1.4.  ANÁLISE COMPARATIVA 
145 

 
xv 
5.2. 
LINHAGEM RECOMBINANTE DE Zymomonas mobilis  
149 
5.2.1. ETAPA PÓS-TRANSFORMAÇÃO  
149 
5.2.2. ADAPTAÇÃO METABÓLICA EM MEIO SINTÉTICO 
150 
5.2.3. ENSAIOS  PRELIMINARES  AVALIANDO  O  CONSUMO  DE 
GLICOSE  E  XILOSE  EM  MEIO  SINTÉTICO  POR  Z.  mobilis 
GENETICAMENTE MODIFICADA 
153 
I.  Planejamento Experimental 
153 
II.  Comparação  do  desempenho  de  diferentes 
clones  
157 
5.2.4. PRODUÇÃO DE ETANOL ATRAVÉS DO PROCESSO SSCF POR 
Zymomonas mobilis RECOMBINANTE  
158 
I.  Adaptação metabólica em meio SSCF 
158 
II.  Processo 
de 
propagação 
mediante 
diferentes estratégias de aclimatação celular 
160 
III. Avaliação  da  produção  de  etanol  a  partir  do 
processo  SSCF  através  de  planejamentos 
experimentais sequenciais 
161 
5.3. 
CONSIDERAÇÕES GERAIS  
169 
 
 
CAPÍTULO 6 
 
 
171 
6.  CONCLUSÕES 
 
171 
6.1. CONCLUSÕES
 
171 
6.2. SUGESTÕES 
174 
 
 
CAPÍTULO 7  
 
 
 
 
 
 
 
175 
7.  REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
175 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
xvi 
SUMÁRIO DE FIGURAS 
 
Figura 2.1. Participação, de países selecionados, no consumo mundial de 
petróleo no ano de 2011.  
8 
Figura 2.2. Evolução do consumo de etanol no Brasil e EUA. 
10 
Figura 2.3. Cana-de-açúcar. 
 
12 
Figura 2.4. Excedente de Palha de cana-de-açúcar. 
 
14 
Figura 2.5. Excedente de Bagaço de cana-de-açúcar. 
15 
Figura 2.6. Diagrama da estrutura das camadas da parede de uma fibra. 
18 
Figura 2.7. Principais componentes de materiais lignocelulósicos. 
20 
Figura 2.8. Estrutura simplificada da cadeia linear da celulose, formada por 
várias unidades consecutivas de celobiose. 
22 
Figura 2.9. Representação das ligações de Hidrogênio na estrutura da 
celulose 
23 
Figura 2.10. Monossacarídeos constituintes das hemiceluloses. 
 
24 
Figura 2.11. Estrutura simplificada da lignina. 
 
 
 
 
25 
Figura 2.12. Efeito do pré-tratamento químico em materiais lignocelulósico. 
26 
Figura 2.13. Atuação sinérgica das celulases.   
 
30 
Figura 2.14. Linhagem Zymomonas mobilis CP4. 
 
 
 
33 
Figura 2.15. Via metabólica de formação de produtos da fermentação de 
carboidratos por Zymomonas mobilis. 
38 
Figura 2.16. Diagrama de blocos do processo de hidrólise enzimática 
separada da fermentação (SHF). 
51 
Figura 2.17. Diagrama de blocos do processo de hidrólise enzimática e 
fementação simultâneas (SSF).    
51 
Figura 2.18. Diagrama de blocos do processo de sacarificação e co-
fermentação simultâneas (SSCF).   
 
 
53 
Figura 2.19. Diagrama de blocos do processo consolidado para a produção 
de etanol de segunda geração (BPC).  
 
53 
Figura 2.20. Metabolismo da xilose, inserido na via Entner-Doudoroff de Z. 
mobilis.  
57 
Figura 2.21. Mapa do plasmídeo 
pZMETX.
 
60 
Figura 4.1. Etapas do pré-tratamento ácido.       
85 
Figura  4.2.  Bagaço  de  cana-de-açúcar  in  natura  (A);  Bagaço  de  cana-de-
açúcar após pré- tratamento ácido (Celulignina) (B).  
85 
Figura 4.3. Etapas do tratamento alcalino. 
86 
Figura 4.4. (A) Fração líquida após pré-tratamento alcalino, (B- E) Sequência 
de lavagens com água destilada para a remoção da lignina residual.    
86 
Figura  4.5.  Perfil  cromatográfico  típico  do  hidrolisado  celulósico  pré-tratado 
enzimaticamente. 
87 
Figura 4.6. Microscopia das linhagens de Zymomonas mobilis. 
88 
Figura 4.7. Linhagem floculante de Z. mobilis CP4, em meio de cultura. 
88 
Figura 4.8. Sistema de operon duplo para os genes do metabolismo de 
xilose. 
96 
Figura 4.9. Microscopia das linhagens de Zymomonas mobilis CP4. 
99 

 
xvii 
recombinante (aumento de 1000 X). 
Figura 4.10. Diagrama de blocos indicando a estratégia empregada para 
aclimatação celular. 
104 
Figura 4.11. Experimento em Biorreator BIOFLO III (New Brunswick). 
106 
Figura 4.12. Sistema cromatrográfico CLAE com detecção por índice 
refração. 
106 
Figura 5.1. Cinética de acompanhamento de consumo de glicose, produção 
de etanol e crescimento celular de Z. mobilis linhagem AG11. 
111 
Figura 5.2. Cinética de acompanhamento de consumo de glicose, produção 
de etanol e crescimento celular de Z. mobilis linhagem CP4 
112 
Figura 5.3. Perfil cromatográfico típico de fermentação de Z.mobilis 
113 
Figura 5.4. Desempenho de Z. mobilis AG11 (A) e CP4 (B) em xilose. 
113 
Figura  5.5.  Material  celulósico  deslignificado  (A),  logo  após  a  adição  de 
enzimas e meio (B) e após a pré-hidrólise enzimática (C) 
115 
Figura  5.6.  Superfície  de  resposta  mostrando  os  efeitos  combinados  da 
relação sólido:líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro B) sobre 
a  concentração  inicial  de  glicose  do  processo  SSF  a  partir  do  bagaço  de 
cana pré-tratado. 
117 
Figura  5.7.  Superfície  de  resposta  mostrando  os  efeitos  combinados  da 
relação sólido:líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro B) sobre 
a  concentração  de  etanol  através  do  processo  SSF  a  partir  do  bagaço  de 
cana pré-tratado por Z. mobilis CP4. 
119 
Figuras  5.8.  Superfícies  de  resposta  mostrando  os  efeitos  combinados  da 
entre (A) relação sólido: líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro 
B),  (B)  relação  sólido:  líquido  (parâmetro  A)  e  concentração  celular 
(parâmetro  C),    (C)  carga  enzimática  (parâmetro  B)  e  concentração  celular 
(parâmetro  C)  sobre  a  produtividade  volumétrica  de  etanol  através  do 
processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4. 
122 
Figura  5.9.  Cinética  do  processo  de  hidrólise  enzimática  de  celulose  e 
fermentação  simultâneas  a  partir  de  bagaço  de  cana pré-tratado através  do 
processo  SSF  por  Z.  mobilis  CP4,  em  frascos  agitados.  Condições 
operacionais: relação sólido líquido 3:10 (g:mL), 25 FPU/g, 4 g/L de células.  
124 
Figura  5.10.  Cinética  do  processo  de  hidrólise  enzimática  de  celulose  e 
fermentação  simultâneas  a  partir  de  bagaço  de  cana pré-tratado através  do 
processo  SSF  por  Z.  mobilis  CP4,  em  biorreator  instrumentado.  Condições 
operacionais: relação sólido líquido 3:10 (g:mL), 25 FPU/g, 4 g/L de células.  
125 
Figura  5.11.  Superfície  de  resposta  mostrando  os  efeitos  da  relação 
sólido:líquido,  carga  enzimática  e  suas  interações  na  produção  de  etanol 
através do processo SSF a partir de resíduos da indústria de celulose por Z. 
mobilis CP4. 
129 
Figura 5.12. Perfil cinético do processo de hidrólise enzimática de celulose e 
fermentação simultâneas a partir de resíduos da indústria de celulose por Z. 
mobilis  CP4,  em  biorreator  instrumentado.  Condições  operacionais:  relação 
sólido:líquido  (2:10  g/mL),  carga  enzimática  (17,5  FPU/g)  e  concentração 
celular (1,59 %). 
129 
Figura  5.13.  Validação  experimental  da  condição  ótima  obtida  no  133 

 
xviii 
Planejamento  fatorial  2
4
,  a  partir  de bagaço de  cana pré-tratado:  2,5 g/L  de 
extrato  de  levedura,  1  g/L  de  KH
2
PO
4
,  0,5  g/L  de  (NH
4
)
2
SO
4
  e  0,5  g/L  de 
MgSO
4
.7H
2
O,  atingindo  53  g/L  de  etanol  em  biorreator  instrumentado. 
Condições:  relação  sólido  líquido  de  3:10  (g:mL),  carga  enzimática  de  25 
FPU/g e concentração inicial de células de 4 g/L. 
Figura 5.14. Superfície de resposta mostrando efeitos de MgSO
4
.7H
2
O (g/L) 
e  (NH
4
)
2
SO
4 
(A);
 
KH
2
PO
4
  (g/L)  e  MgSO
4
.7H
2
O  (g/L)  (B);  KH
2
PO
4
  (g/L)  e 
(NH
4
)
2
SO
4 
e suas interações para a produção de etanol (C). 
137 
Figura 5.15. Cinética da produção de etanol a partir de bagaço de cana pré-
tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/ 
g, através do processo SSF por Z. mobilis CP4, utilizando 12,5 g/L de extrato 
de  levedura,  2,5  g/L  de  KH
2
PO
4
,  1,25  g/L  de  (NH
4
)
2
SO
4 
e  0,5  g/L 
MgSO
4
.7H
2
O no meio fermentativo. 
139 
Figura  5.16.  Superfícies  de  resposta  mostrando  efeitos  de  extrato  de 
levedura  e  MgSO
4
.7H
2
O
 
(A);
 
KH
2
PO
4
  e  (NH4)
2
SO
4
  (B);  (NH
4
)
2
SO
4
  e
 
MgSO
4
.7H
2
O
 
(C)  e  suas  interações  para  a  produção  de  etanol  a  partir  de 
resíduo da indústria de celulose. 
143 
Figura 5.17.
 
Cinética da melhor condição obtida (extrato de levedura, 5 g/L; 
KH
2
PO
4
, 1 g/L; (NH4)
2
SO
4
, 2 g/L e MgSO
4
.7H
2
O, 2 g/L) para a produção de 
etanol  através  do  processo  SSF  por  Z.  mobilis  CP4  a  partir  de  resíduo  da 
indústria de celulose, em biorreator instrumentado. 
144 
Figura 5.18. Crescimento de diferentes linhagens após 168 h de crescimento 
a 30
○
C frente à utilização de meio RMG, contendo glicose (20 g/L), KH
2
PO
4
 
(2 g/L), extrato de levedura (10 g/L), ágar (20 g/L) e tetraciclina (10 mg/L). 
149 
Figura 5.19. 
Histograma representando os 50 ciclos de adaptação metabólica, 
empregando a linhagem recombinante de Z. mobilis em meio sintético. 
Figura  5.20.  Superfície  de  contorno  avaliando  efeitos  combinados  entre  a 
glicose  (Parâmetro  A) e  a  xilose  (Parâmetro  B)  sobre  a produção  de etanol 
por Zymomonas mobilis recombinante.
 
152 
 
156 
 
Figura  5.21.  Cinética  comparativa  de  diferentes  clones  selecionados  após 
crescimento  em  meio  RMGX  durante  72  horas,  em  30
○
C  de  temperatura  e 
agitação de 150 rpm
 
158 
Figura  5.22.  Superfície  de  contorno  avaliando  efeitos  combinados  entre  os 
parâmetros  sobre  a  produção  de  etanol  a  partir  do  primeiro  Planejamento 
referente ao processo SSCF pela linhagem recombinante de Z. mobilis.  
164 
Figura  5.23.  Superfície  de  contorno  avaliando  efeitos  combinados  entre  os 
parâmetros  sobre  a  produção  de  etanol  a  partir  do  segundo  Planejamento 
referente ao processo SSCF pela linhagem recombinante de Z. mobilis. 
165 
Figura  5.24.  Processo  SSCF2  em  biorreator  instrumento  por  Z.  mobilis 
modificada, empregando 20,5% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico e 2,99:10 
(g:mL) de relação sólido:líquido de bagaço de cana pré-tratado. 
 
 
 
166 

 
xix 
SUMÁRIO DE TABELAS 
 
Tabela 2.1. Perspectivas da produção de etanol. 
11 
Tabela 2.2. Composição química média do bagaço de cana.  
16 
Tabela 2.3. Composição química dos resíduos agrícolas (%). 
21 
Tabela  2.4.  Principais  resultados  relatados  na  literatura  para  produção  de 
etanol convencional por Zymomonas mobilis. 
46