Ocorrente e recombinante, empregando

Figura 5.8. Superfícies de resposta mostrando os efeitos combinados da entre 
(A) relação sólido: líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro B), (B) 
relação sólido: líquido (parâmetro A) e concentração celular (parâmetro C), (C) 
carga  enzimática (parâmetro  B)  e  concentração  celular  (parâmetro  C)  sobre  a 
produtividade  volumétrica  de  etanol  através  do  processo  SSF  a  partir  do 
bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4. 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
123     
 
A  interação  entre  a  carga  enzimática  (B)  e  a  concentração  celular  (C), 
mantendo-se  a  relação  sólido:líquido  no  seu  ponto  central,  indica  que  os 
maiores  valores  de produtividade  volumétrica  ocorrem  nos  níveis  máximos  de 
carga  enzimática  e  de  concentração  de  células  (Fig.  5.8  C).  Quando  a  carga 
enzimática é baixa, a liberação de glicose no processo  é muito lenta, fazendo 
com  que  a  concentração  de  etanol  e  a  produtividade  volumétrica  diminuam. 
Desta forma, quando eram aplicados altos níveis de carga enzimática, a glicose 
era  hidrolisada  mais  rapidamente,  promovendo  aumento  da  produtividade 
volumétrica  de  etanol;  uma  vez  que  este  carboidrato  era  simultaneamente 
metabolizado  pelas  células  bacterianas,  as  quais  também  estavam  presentes 
em altas concentrações. 
 
O    modelo  resultante  da  produtividade  volumétrica  em  etanol  é 
apresentado na equação (3): 
Produtividade  Volumétrica  =  -  3.17128  +  1.61333ª  +  0.20374B  +  0.67448C-
0.012667AB  -  0.10500AC  -  9.00000E-003BC  -  0.33342A
2
  -  4.35605E-003B
2
-
0.078147C
2
 +7.00000E-003ABC                                                         (3)      
O melhor resultado do planejamento experimental apresenta-se a seguir: 
concentração inicial  de  glicose do  SSF  (76  g/L),  concentração  final  etanol  (60 
g/L) e produtividade volumétrica (1,5 g/L.h); a partir da relação sólido:líquido de 
3:10,  carga  enzimática  de  25  FPU/g  e  concentração  celular  de  4  g/L  (Figura 
5.9).  
Observou-se  que  os  resultados  estão  de  acordo  com  as  respostas 
previsíveis  pelo  modelo.  Neste  experimento,  realizado  em  frascos  agitados,  a 
glicose  foi  convertida  a  etanol  no  período  de  36  horas  de  fermentação,  sem 
controle pH, na temperatura de 30ºC e agitação orbital de 150 rpm. O tempo de 
fermentação foi um fator decisivo na fermentação quando a glicose era gerada 
em  altas  concentrações;  segundo  Cazetta  et  al.  (2007),  a  concentração  de 
etanol pode aumentar em até 60% de 24 para 48 h. 
 
 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
124     
Figura  5.9.  Cinética  do  processo  de  hidrólise  enzimática  de  celulose  e 
fermentação  simultâneas  a  partir  de  bagaço  de  cana  pré-tratado  através  do 
processo  SSF  por  Z.  mobilis  CP4,  em  frascos  agitados.  Condições 
operacionais:  relação  sólido  líquido  3:10  (g:mL),  25  FPU/g,  4  g/L  de  células. 
P.H.= pré-hidrólise enzimática, SSF: fermentação e sacarificação simultâneas. 
A  reprodução  da  melhor  condição  alcançada  no  planejamento 
experimental, o qual foi realizado em frascos agitados (Figura 5.9), ocorreu em 
biorreator  sob  condições  controladas,  obtendo-se  a  concentração  inicial  de 
glicose  do  SSF  em  80  g/L,  concentração  final  de  etanol  de  55  g/L  e 
produtividade  volumétrica  de  2,3  g/L.h,  com  um  tempo  de  fermentação  de 
aproximadamente  24  horas,  na  temperatura  de  30ºC,  agitação  orbital  de  150 
rpm  e  pH  5  (Fig.  5.10).
 
Observa-se  que  os  resultados  de  produção  de  etanol 
obtidos  em  frascos  agitados  foram  semelhantes  aos  obtidos  em  biorreator, 
embora  a  produtividade  volumétrica  tenha  sido  maior  no  experimento  em 
biorreator. 
 O  presente estudo  apresentou  os  melhores resultados  de  produção de 
etanol  de  lignocelulósicos  por  Zymomonas  mobilis  não  recombinante 
reportados  na  literatura,  atingindo  a  concentração  de  etanol  de  60  g/L,  valor 
próximo ao obtido por Vásquez (2007), que atingiu 70 g/L de etanol a partir de 
P.H. 
SSF 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
125     
processo  SSF  de  bagaço  de  cana  sob  condições  semelhantes,  utilizando  a 
levedura Saccharomyces cerevisae.  
 
 
Figura  5.10.  Perfil  cinético  do  processo  de  hidrólise  enzimática  de  celulose  e 
fermentação simultâneas a partir de bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis 
CP4,  em  biorreator  instrumentado.  Condições  operacionais:  relação  sólido 
líquido 3:10 (g:mL), 25 FPU/g, 4 g/L de células. P.H.= pré-hidrólise enzimática, 
SSF: fermentação e sacarificação simultâneas. 
As maiores diferenças entre os resultados da fermentação pela bactéria 
Z.  mobilis  no  presente  estudo  e  pela  levedura  S.  cerevisae,  reportadas  por 
Vásquez (2007) foram: composição do meio, no qual foram utilizados meios de 
fermentação  com  nutrientes  e  tampão-citrato,  e  temperatura  de  fermentação 
em torno de 37°C e de 30°C, respectivamente, o que possibilitou uma hidrólise 
mais eficiente no experimento com a levedura, pois a temperatura se mantinha 
mais próxima da ótima para a atividade de celulases (50°C), além da presença 
do tampão possibilitar uma maior estabilidade do pH.  
 
P.H. 
SSF 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
126     
II. 
Resíduos da indústria de celulose 
Visando comparar a produção de etanol a partir de resíduos da indústria 
de celulose com a utilização do bagaço de cana como matéria-prima através do 
processo  de  fermentação  por  Zymomonas  mobilis  e  sacarificação  simultânea, 
um  planejamento  experimental  do  tipo  delineamento  superfície  de  resposta  2
3
 
avaliando  o  processo  SSF  a  partir  de  PM2  também  foi  utilizado,  onde  os 
parâmetros  analisados  foram  a  relação  de  sólido:líquido  (g:mL),  carga 
enzimática  (FPU/g)  e  concentração  células  (%).  Na  sequência,  na  tabela  5.6, 
são  apresentados  os  experimentos  referentes  à  utilização  do  resíduo  PM2 
como fonte de carbono para a produção de etanol por Z. mobilis.  
Tabela  5.6.  Planejamento  Superfície  de  Resposta  2
4
  investigando  efeitos  da 
Relação  sólido:líquido  (g:mL),  Carga  enzimática  (FPU/g)  e  Concentração 
celular (%) na produção de etanol a partir de resíduos da indústria de celulose 
por Z. mobilis CP4.  
 
Ex. 
Condições 
Resposta 
 
S:L (g:L) 
CE (FPU/g) 
X
o 
(%) 
Etanol (g/L) 
1 
0,32:10 
17,5 
10,00 
3,7 
2 
2:10 
17,5 
18,41 
29,2 
3 
2:10 
17,5 
10,00 
29,7 
4 
3:10 
10,0 
14,21 
5,5 
5 
2:10 
17,5 
10,00 
31,1 
6 
3:10 
10,0 
5,80 
5,5 
7 
1:10 
 
 10,0 
5,80 
4,0 
8 
3:10 
25,0 
14,21 
19,4 
9 
2:10 
17,5 
10,00 
28,3 
10 
2:10 
17,5 
10,00 
28,3 
11 
1:10 
10,0 
14,21 
7,2 
12 
1:10 
25,0 
5,80 
4,3 
13 
1:10 
25,0 
14,21 
2,5 
14 
2:10 
30,1 
10,00 
2,1 
15 
3:10 
25,0 
5,80 
20,7 
16 
2:10 
17,5 
1,59 
53,9 
17 
3,68:10 
17,5 
10,00 
12,8 
18 
2:10 
17,5 
10,00 
29,8 
19 
2:10 
25,0 
10,00 
9,6 
20 
2:10 
4,89 
10,00 
29,8 
  Onde: S:L: relação sólido:líquido, CE: carga enzimática, Q
P=
 produtividade 
volumétrica, X
0
=concentração celular.  
Observa-se  que  nos  experimentos  1,  7,  11,  12  e  13,  os  quais 
apresentaram  baixas  relações  de  sólidos  (variável  A),  as  concentrações  de 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
127     
etanol  foram  reduzidas  quando  comparados  às  outras  condições,  entretanto, 
nos  experimento  4,  6  e  17,  que  possuíam  elevada  relação  sólido:líquido,  a 
produção  de  etanol  foi  inibida  de  forma  semelhante.  Contudo,  analisando  os 
experimentos  8  e  15  nota-se  que  as  variáveis  A  e  B,  quando  duplamente 
alteradas, não causam inibição no processo por apresentarem elevado grau de 
sinergismo.  Este  fato  também  é  observado  nos  experimentos  14  e  19,  onde, 
respectivamente, a carga enzimática manteve-se no nível +

 e no nível -

 e a 
relação sólido:líquido manteve-se no ponto central.   
Quando  as  3  variáveis  avaliadas  estatisticamente  encontravam-se  em 
seus  pontos  centrais,  nos  experimentos  3,  5,  9,  10,  18  e  20,  a  produção  de 
etanol  ocorreu  eu  torno  de  30  g/L,  mostrando  elevada  reprodutibilidade  no 
processo.  Ao  compararmos  os  experimentos  2  e  16  nota-se  que  a  elevada 
concentração celular provocou inibição no processo, atingindo 29,2 g/L e 53,9 
g/L de etanol, quando a mesma apresentava-se em seu nível inferior e superior, 
respectivamente.  
Na  tabela  5.7  observa-se  a  análise  de  variância  obtida  pelo 
planejamento  experimental,  o  qual  se  mostrou  significativo,  permitindo  a 
avaliação preditiva dos valores gerados pelo método. O modelo quadrático foi o 
escolhido  para  a  análise  estatística,  por  apresentar  maior  significância 
(p<0,05),  bem  como  maior  valor  de  R
2 
observado  para  a  produção  de  etanol, 
em  0,8535.  O  parâmetro  A  (Relação  sólido:líquido)  apresentou  a  maior 
influência, seguido do parâmetro C (Concentração celular), que, por sua vez foi 
superior ao parâmetro B (Carga enzimática), que apresentou baixos valores de 
Soma  dos  Quadrados.   Apesar  de  apenas  a  variável A  apresentar  relevância 
estatística,  o  modelo  foi  mantido  hierárquico,  ou  seja,  completo  com  seus 
parâmetros  e  interações,  se  mantendo  altamente  significativo.  Dentre  as 
interações  duplas,  a  mais  influente  foi  a  AB  (Relação  sólido:líquido  e  Carga 
enzimática),  seguida  de  BC  (Carga  enzimática  e  Concentração  celular),  e AC 
(Relação  sólido:líquido  e  Concentração  celular),  apresentando-se  pouco 
significativa.  

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
128     
A  equação  referente  à  concentração  de  etanol  é  apresentada  na 
equação (4).  
[Etanol]= + 29,78 + 3,56A + 0,88B - 3,04C + 4,18AB - 0,33AC - 0,78BC -
9,47A
2 
- 10,32B
2 
+ 2,30C
2    
 
 
 
 
 
 
 (4) 
Tabela  5.7.  Análise  de  Variância  da  concentração  de  etanol  através  do 
processo SSF a partir de resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis CP4, 
utilizando o Planejamento Superfície de Resposta 2
4
, o qual avaliou os  efeitos 
da  Relação  sólido:líquido  (g:mL),  Carga  enzimática  (FPU/g)  e  Concentração 
celular (%). 
 
SQ 
GL 
MQ 
F-Valor 
p-valor 
Modelo 
3272,84 
9 
363,65 
6,47 
0,0037 
A 
173,22 
1 
173,22 
3,08 
0,1096 
B 
10,46 
1 
10,46 
0,19 
0,6753 
C 
125,95 
1 
125,95 
2,24 
0,1652 
AB 
139,86 
1 
139,86 
2,49 
0,1457 
AC 
0,88 
1 
0,88 
0,016 
0,9030 
BC 
4,88 
1 
4,88 
0,087 
0,7742 
A
2
 
1292,08 
1 
1292,08 
23,00 
0,0007 
B
2
 
1534,04 
1 
1534,04 
27,30 
0,0004 
C
2
 
76,54 
1 
76,54 
1,36 
0,2702 
Residual 
561,88 
10 
56,19 
 
 
Lack of Fit 
556,42 
5 
111,28 
101,75 
<0,0001 
Erro Puro  
5,47 
5 
1,09 
6,47 
0,0037 
SQ= Soma dos Quadrados, GL= Grau de Liberdade, MQ= Média Quadrática, 
A= relação sólido:líquido, B= carga enzimática, C= concentração celular. 
 
A  figura  5.11  indica  as  interações  entre  Relação  sólido:líquido  e  Carga 
enzimática,  mantendo-se  a  Concentração  celular  no  Ponto  Central.  Nota-se 
que  a  produção  de  etanol  alcançada  foi  em  torno  de  25  g/L,  quando  ambos 
parâmetros  (A  e  B)  estão  em  seus  níveis  médios.  Experimentalmente,  foram 
alcançados  29,75  g/L  quando  todos  os  parâmetros  mantinham-se  em  seus 
pontos centrais, resultado próximo do teórico indicado pelo modelo.  
No  entanto,  as  condições  ótimas  obtidas  para  a  produção  de  etanol 
através  do  processo  SSF  a  partir  de  PM2  ocorreram  quando  a  Relação 
sólido:líquido  estava  em  seu  nível  médio  (2:10  g/mL),  a  Carga  enzimática 
estava  em  seu  nível  médio  (17,5  FPU/g)  e a  Concentração  celular  estava  no 
seu  menor  nível  (1,59  %  v/v),  resultando    na  máxima  concentração  de  etanol 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
129     
em  58  g/L,  a  partir  de  82  g/L  de  glicose  inicial  do  processo  e  produtividade 
volumétrica  de  2,76  g/L.h,  em  biorreator  instrumentado,  na  temperatura  de 
30ºC, 150 rpm de agitação e pH 5 (Figura 5.12). 
 
Figura 5.11. Superfície de resposta mostrando os efeitos da relação sólido:líquido, 
carga  enzimática  e  suas  interações  na  produção  de  etanol  através  do  processo 
SSF a partir de resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis CP4. 
 
Figura  5.12.  Perfil  cinético  do  processo  de  hidrólise  enzimática  de  celulose  e 
fermentação  simultâneas  a  partir  de  resíduos  da  indústria  de  celulose  por  Z. 
mobilis  CP4,  em  biorreator  instrumentado.  Condições  operacionais:  relação 
P.H. 
SSF 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
130     
sólido:líquido  (2:10  g/mL),  carga  enzimática  (17,5  FPU/g)  e  concentração  celular 
(1,59 %). 
5.1.3.  Análise da adição de diferentes componentes do meio no processo 
SSF frente à produção de etanol a partir por Z. mobilis CP4 nativa  
I. 
Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado  
Foram  desenvolvidos  planejamentos  sequenciais  objetivando-se  avaliar 
a  influência  dos nutrientes  dos  componentes  complementares  ao  processo de 
sacarificação  e  fermentação  simultâneas,  tais  como  extrato  de  levedura, 
KH
2
PO
4
,  (NH
4
)
2
SO
4
  e  MgSO
4
.7H
2
O,  para  posterior  produção  de  etanol  por 
Zymomonas mobilis. 
Delineamento fatorial  
Inicialmente, 
foi  realizado  um  delineamento  fatorial  completo  2
4
,  o  qual 
gerou o de total de 19 experimentos, sendo 16 experimentos correspondentes 
à  distribuição  fatorial  e  3  réplicas  do  ponto  central  (Tabela  5.8).  A  maior 
produção  de  etanol  (53  g/L)  foi  atingida  com  as  concentrações  de  2,5  g/L  de 
extrato  de  levedura,  1  g/L  de  KH
2
PO
4
,  0,5  g/L  de  (NH
4
)
2
SO
4
  e  0,5  g/L  de 
MgSO
4
.7H
2
O. 
 A presença de extrato de levedura promoveu um aumento na produção 
de etanol, conforme observado nos experimentos 1 e 18, os quais possuem as 
mesmas  concentrações  dos outros  nutrientes  (exceto  de extrato  de levedura). 
Dessa forma, quando tal fonte de nitrogênio foi adicionada, a concentração de 
etanol variou de 11 g/L para 53 g/L, respectivamente. 
No experimento 10 não houve adição de nutrientes complementares, no 
entanto,  a  produção  de  etanol  ocorreu  em  7  g/L,  que  pode  ser  explicada pela 
presença de 44,6% de carbono, 5,8% de hidrogênio, 44,5% de oxigênio, 0,6% 
de nitrogênio, 0,1% de enxofre e 4,4% de outros elementos no bagaço de cana 
(SIMÕES  et  al.,  2005).  Embora,  visando  à  obtenção  de  resultados  mais 
promissores,  a  bactéria  Z.  mobilis  necessita  de  outros  nutrientes  que 
contenham  alguns  elementos  químicos,  como  o  magnésio  e  o  fósforo,  no  que 
tange  ao  melhor  funcionamento  do  metabolismo  e  à  síntese  celular 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
131     
(OTHUMPANGAT  et  al.,  1999).  Portanto,  como  mostrado  na  literatura  e 
confirmado  nos  experimentos  do  presente  estudo,  os  seguintes  nutrientes, 
extrato de levedura, KH
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
 e MgSO
4
.7H
2
O, foram essenciais para 
a produção de etanol nestes experimentos.  
Tabela  5.8.  Planejamento  fatorial  2
4
,  avaliando  efeitos  da  concentração  de 
extrato de levedura (g/L), KH
2
PO
4
(g/L), (NH
4
)
2
SO
4
 (g/L) e MgSO
4
.7H
2
O (g/L) na 
produção de etanol através do processo  SSF a partir de bagaço de cana pré-
tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/ g, 
por Z. mobilis CP4. 
 
 
Ex. 
VARIÁVEIS 
RESPOSTA 
E. L.  
(g/L) 
KH
2
PO
4
 
(g/L) 
(NH
4
)
2
 SO
4
 
(g/L) 
MgSO
4
.7H
2
O 
(g/L) 
Etanol 
(g/L) 
1 
0,00 
1,0 
0,50 
0,50 
11 
2 
0,00 
1,0 
0,50 
0,00 
6 
3 
2,50 
0,0 
0,50 
0,50 
38 
4 
2,50 
0,0 
0,50 
0,00 
38 
5 
0,00 
1,0 
0,00 
0,00 
15 
6 
0,00 
0,0 
0,50 
0,00 
11 
7 
1,25 
0,5 
0,25 
0,25 
40 
8 
2,50 
1,0 
0,50 
0,00 
14 
9 
2,50 
1,0 
0,00 
0,00 
13 
10 
0,00 
0,0 
0,00 
0,00 
7 
11 
0,00 
0,0 
0,50 
0,50 
12 
12 
2,50 
0,0 
0,00 
0,00 
12 
13 
1,25 
0,5 
0,25 
0,25 
43 
14 
0,00 
0,0 
0,00 
0,50 
15 
15 
2,50 
0,0 
0,00 
0,50 
34 
16 
2,50 
1,0 
0,00 
0,50 
9 
17 
1,25 
0,5 
0,25 
0,25 
45 
18 
2,50 
1,0 
0,50 
0,50 
53 
19 
0,00 
1,0 
0,00 
0,50 
13 
Onde: E.L.= extrato de levedura. 
A  análise  estatística  da  variância  obtida  pelo  planejamento  fatorial, 
conforme  indicada  na  tabela  5.9,  mostra  que  o  modelo  foi  significativo, 
apresentando p<0,05, assim como o valor do coeficiente de determinação total 
(R
2
)  observado  para  a  resposta  de  produção  de  etanol,  em  0,995,  sugerindo 
um bom ajuste do modelo aos dados experimentais.  
Além disso, o resíduo foi baixo, mostrando-se não significativo (p>0,05), 
o  que  não  invalidou  o  modelo  para  fins  preditivos.  As  interações  duplas  entre 
os  nutrientes  complementares  apresentaram-se  significativas,  sendo  a 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
132     
interação  AC  (Extrato  de  levedura  e  (NH
4
)
2
SO
4
)  a  mais  influente,  seguida  da 
interação  AD  (Extrato  de  levedura  e  MgSO
4
.7H
2
O)  e  entre  BD  (KH
2
PO
4
  e 
MgSO
4
.7H
2
O),  mostrando-se  mais  significativas  do  que  as  variáveis 
independentes.  Dentre  os  influências  individuais  de  cada  variável  avaliada,  o 
efeito linear do extrato de levedura (parâmetro A) se apresentou mais influente, 
seguido do KH
2
PO
4 
(parâmetro B), que por sua vez foi mais significativo do que 
o  MgSO
4
.7H
2
O  (parâmetro  D)  e,  por  fim,  o  (NH
4
)
2
SO
4 
(parâmetro  C),  que 
possui baixos valores de Fisher. A interação entre as quatro variáveis também 
apresentou  elevados  valores  de  Fisher,  o  que  indica  o  grande  sinergismo 
existente  entre  os  nutrientes  na  fermentação  por  Z.  mobilis,  proporcionando 
maiores concentrações de etanol.