Ocorrente e recombinante, empregando

partir por Z. mobilis CP4 nativa  
 
Foram  desenvolvidos  planejamentos  sequenciais  no  intuito  de  verificar  o 
efeito estimado dos seguintes componentes do meio de fermentação, extrato de 
levedura, KH
2
PO
4
, (NH4)
2
SO
4
 e MgSO
4
.7H
2
O,  para obtenção de etanol a partir 
do  processo  SSF  por  Z.  mobilis.  Inicialmente,  foi  realizado  um  Planejamento 
Experimental Fatorial 2
4
 empregando o bagaço de cana, o qual promoveu o total 
de 19 experimentos (16 experimentos e 3 pontos centrais) (Tabela 4.6). 
PARÂMETROS 
Níveis 
-

 
- 
0 
+ 
+

 
A 
Relação Sólido:líquido (g:mL) 
0,32:10  1:10  2:10  3:10  3,68:10 
B 
Carga Enzimática (FPU/g) 
4,89 
10 
17,5 
25 
30,11 
C 
Concentração Celular (g/L) 
0,02 
1 
2,5 
4 
5,02 
 
PARÂMETROS 
Níveis 
-

 
- 
0 
+ 
+

 
A 
Relação Sólido:líquido (g:mL)  0,32:10 
1:10 
2:10 
3:10 
3,68:10 
B 
Carga Enzimática (FPU/g) 
4,89 
10 
17,5 
25 
30,11 
C 
Concentração Celular (g/L) 
1,59 
5,80 
10 
14,21 
18,41 

CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
94 
 O  planejamento  fatorial  geralmente  foi  escolhido  por  ser  o  mais 
apropriado na determinação dos efeitos lineares  das variáveis, sendo os efeitos 
da curvatura e das possíveis interações excluídos da análise estatística. Porém, 
a  redução  do  número  de  experimentos  realizados  acarreta  perdas  quanto  à 
análise da influência de interações entre as variáveis de estudo sobre a resposta 
de  interesse  (BRUNS,  1995).  Dessa  forma,  em  uma  segunda  estratégia,  o 
planejamento experimental composto central foi necessário para visualização da 
curvatura com valor de máximo absoluto. 
Tabela 4.6. Parâmetros e níveis usados no Planejamento Experimental Fatorial 
2
4
: extrato de levedura (g/L), KH
2
PO
4
(g/L), (NH4)
2
SO
4
 (g/L) e MgSO
4
.7H
2
O (g/L), 
adicionados no hidrolisado celulósico do bagaço de cana. 
Parâmetros (g/L) 
Níveis 
- 
0 
+ 
Extrato de Levedura  
0,0 
1,25 
2,5 
KH
2
PO
4  
 
0,0 
0,5 
1,0 
(NH
4
)
2
SO
4 
 
0,0 
0,25 
0,5 
MgSO
4
.7H
2
O 
0,0 
0,25 
0,5 
 
Nesse sentido, visando avaliar a superfície de resposta frente à adição de 
diferentes componentes do meio no hidrolisado celulósico do bagaço de cana e 
no resíduo da indústria de celulose no que tange à produção de etanol a partir 
por  Z.  mobilis  CP4  nativa,  posteriormente,  foi  desenvolvido  o  planejamento 
composto  central,  onde  os  parâmetros  analisados  foram  mantidos.  Tais 
nutrientes adicionados à biomassa celulósica no início da hidrólise enzimática, 
juntamente  com  a  glicose  gerada,  permitiram  a  execução  da  técnica  SSF 
(Tabela 4.7).  
Tabela  4.7.  Variáveis  independentes  do  planejamento  central  composto 
avaliando a adição de extrato de levedura (g/L), KH
2
PO
4
(g/L), (NH4)
2
SO
4
 (g/L) e 
MgSO
4
.7H
2
O  (g/L)  no  hidrolisado  celulósico  do  bagaço  e  de  PM2  frente  à 
produção de etanol através do processo SSF por Z. mobilis CP4 nativa. 
 
PARÂMETROS 
Níveis 
-

 
- 
0 
+ 
+

 
A 
Extrato de Levedura (g/L) 
0,0 
6,25 
12,5 
18,75 
25,0 
B 
KH
2
PO
4  
(g/L) 
0,0 
1,25 
2,5 
3,75 
5,0 
C 
(NH
4
)
2
SO
4 
(g/L) 
0,0 
0,75 
1,5 
2,25 
3,0 
D 
MgSO
4
.7H
2
O(g/L) 
0,0 
0,75 
1,5 
2,25 
3,0 

CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
95 
4.5.  LINHAGEM RECOMBINANTE DE Zymomonas mobilis  
4.4.1. APLICAÇÃO DA ENGENHARIA GENÉTICA EM Z. mobilis  
Objetivando-se  tornar  a  produção  de  etanol  de  segunda  geração  mais 
eficiente foram sintetizados os genes responsáveis pela metabolização da xilose 
(XI,  XK,  TAL  e  TKT),  os  quais  foram  inseridos  na  linhagem  CP4  do 
microrganismo Zymomonas mobilis, segundo a metodologia adaptada de Zhang 
et al. (1995), Liang et al. (1998) e Agrawal et al. (2011).  
4.4.1.1. Desenho dos genes 
Os  genes  sintéticos  que  codificam  para  xilose  isomerase,  xiluloquinase, 
transaldolase  e  transquetolase,  assim  como  dois  operons,  cada  um  sob  o 
controle  do  forte  promotor  constitutivo  Pgap  de  Z.  mobilis,  foram  construídos 
através  de  síntese  química  na  empresa
 
Life  Sciences  Advanced  Technologies, 
Inc.,  a  partir  de  dados  do  genoma  de  E.  coli  e  Z.  mobilis.  O  plasmídio  pZMO1 
(1565  kb)  de  Z.  mobilis  (ARVANITIS  et  al.,  2000),  que  demonstrou  estabilidade 
nesta  bactéria,  também  foi  sintetizado  quimicamente  e  clonado  em  um  vetor 
sintético  bifuncional  para  Z.  mobilis  e  E.  coli.  Este  vetor  apresenta  a origem  de 
replicação de E. coli, bem como a marca de seleção de resistência a tetraciclina. 
Neste  contexto,  os  segmentos  bem  definidos  de  E.  coli  facilitam  a  manutenção 
dos  plasmídeos,  enquanto  os  de  Z.  mobilis  inclui  sequências  genéticas 
responsáveis pela replicação.  
Adicionalmente, foi desenvolvido um controle contendo um plasmídeo que 
possui  apenas  os  genes  de  origem  de  replicação  de  Zymomonas  mobilis  e  E. 
coli, bem como a resistência à tetraciclina, sendo nomeado de ORI; o plasmídeo 
contendo todos os genes descritos, além dos genes de metabolização da xilose 
(XI, XK, TAL e TKT) foi nomeado de ORI ZYMO. A seguir, a figura 4.8 mostra a 
organização do sistema de operon duplo (em  média ~3,2 kb) para os genes de 
assimilação  e  metabolização  da  xilose,  sob  o  controle  do  promotor  Pgap, 
inseridos no plasmídeo pZMO1.  

CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
96 
 
Figura  4.8.  Mapa  do  plasmídeo 
pZM01,  o qual apresenta o s
istema de operon 
duplo  para  os  genes  do  metabolismo  de  xilose. 
Onde:  Pgap,  promotor 
gliceraldeído-3-fosfato; 
XI, 
xilose 
isomerase; 
XK, 
xilulokinase; 
TAL, 
transaldolase;  TKT,  transquetolase;  Tc,  gene  de  resistência  à  tetraciclina  (4,2 
kb); ZM22, origem de replicação de Zymomonas mobilis (5,9 kb).  
 
4.4.1.2. Amplificação gênica em E. coli  
Para a amplificação dos genes através de transformação genética em  E. 
coli 
DH5α
  foram  utilizados  1  µl  de 
pZM01  (50  ng). 
O  plasmídeo  foi  adicionado 
para  cada  alíquota  de  célula  competente  e  incubado  no  gelo  por  45  minutos. 
Posteriormente, o choque térmico foi realizado na temperatura de 42°C, durante 
90  segundos;  seguido  de  incubação  a  37°C  por  45  minutos,  agitação  de  200 
rpm,  empregando  1mL  de  meio  LB.  Em  seguida,  as  células  foram  plaqueadas 
em  meio  LB  na  presença  do  antibiótico  (tetraciclina,  10  mg/L)  sob  37°C  de 
temperatura,  durante  24  horas.  Este  método,  adaptado  de  Sambrook  &  Russel 
(2001),  tem  sido  frequentemente  utilizado  por  não  prescindir  equipamentos 
sofisticados (AZEVEDO et al., 2003).  
4.4.1.3. Extração do DNA  
 
Inicialmente,  dois  inóculos  das  culturas  transformadas  de  E.  coli  foram 
cultivados  em  200  mL  de  meio  LB,  contendo  10  mg/L  de  tetraciclina,  na 
temperatura  de  37°C,  durante  24  h.  A  extração  de  DNA  em  larga  escala 
(maxipreparação), desenvolvida segundo metodologia de Azevedo et al. (2003), 
ocorreu  após  o  procedimento  de  transformação  em  E.  coli  (citado  no  item 
anterior).  

CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
97 
Adicionalmente,  a  lise  das  membranas  plasmáticas  é  solubilizada  por 
agentes que rompem associações hidrofóbicas e destroem a bicamada lipídica. 
Assim  sendo,  bactérias  gram-negativas  necessitam  de  detergentes  iônicos  e 
substâncias  alcalinas  para  o  rompimento  da  parede  celular  (AZEVEDO  et  al., 
2003).  
4.4.1.3. Transformação em Zymomonas mobilis 
O processo de introdução de um DNA exógeno em uma célula hospedeira 
pode  ser  desenvolvido  através  da  conjugação,  transdução  e transformação.  No 
presente trabalho, a transformação do microrganismo Z. mobilis foi desenvolvida 
através  da  eletroporação,  baseada  em  estudos  de    Zou  et  al.  (2012);  Liang  & 
Lee (1998); e Zhang et al. (1995).  
Cabe ressaltar que a eficiência desta técnica é afetada por alguns fatores, 
como  origem  e  tamanho  do  plasmídeo,  fase  de  crescimento  das  células, 
intensidade  da  corrente  elétrica  e  tempo  de  crescimento  após  transformação 
(ZOU et al., 2012).  
Neste  contexto,  alguns  pesquisadores,  tais  como  Carey  et  al.  (1983)  e 
Dally  et  al.  (1982)  realizaram  a  conjugação  para  este  procedimento;  porém  há 
controvérsias sobre a sua eficácia, pois o crescimento da bactéria é reduzido no 
meio  mineral  utilizado  para  a  seleção,  bem  como  a  produção  de  substâncias 
anti-bactericidas  podem  provocar  a  morte  do  microrganismo  doador  dos  genes 
(GOODMAN  et  al.,  1982).  A  eletroporação  apresenta-se,  portanto,  como  o 
método mais conveniente para a transformação genética (LIANG & LEE, 1998).  
I. 
Células competentes de Z. mobilis 
No  que  tange  à  inserção  de  genes  através  da  transformação  faz-se 
necessário  tornar  as  células  competentes  para  viabilizar  a  introdução  do  DNA 
exógeno  no  hospedeiro  selecionado.  Assim  sendo,  o  protocolo  de  células 
competentes  de  Zymomonas  mobilis  desenvolvido  no  presente  trabalho  foi 
baseado na metodologia de Liang & Lee (1998).  
Após atingir a Abs
600 
de 0,36, o inóculo (100  mL) foi centrifugado a 4000 
rpm  por  5  minutos  a  4
o
C,  sendo  o  sobrenadante  descartado  e  o  pellet 

CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
98 
ressuspendido em 10 mL de solução contendo água destilada estéril (adicionada 
de  10%  de  glicerol,  suplementado  com  0,85%  de  NaCl).  A  etapa  de 
centrifugação foi repetida nas mesmas condições, seguida da adição de solução 
contendo 2 mL de água destilada (10% de glicerol).  
II. 
Plasmídeo exógeno  
O  plasmídeo  extraído,  descrito  no  item  4.4.1.3,  foi  concentrado  após 
liofilização e, posteriormente, teve o volume ajustado para 30 µl.  Após medição 
de  absorbância  (260-280  nm),  a  sua  concentração  foi  calculada  em  10  mg/µL 
para ORI ZYMO e 23 mg/µL para ORI.  
III. 
Eletroporação  
No seguinte, células de Z. mobilis foram transformadas por eletroporação, 
através  do  equipamento  BioRad  GenePulser  Xcell
™
. 
As  colônias  foram 
transferidas  para  a  cubeta  de  eletroporação  (0,2  cm),  mantida  em  baixas 
temperaturas  e, então, transformadas nas seguintes condições: 1,5KV por cm
3
, 
75KV/cm, 25µF e 200Ω.
  
4.4.1.4. Etapa pós-transformação 
Imediatamente após diferentes culturas de Z. mobilis [ORI, ORI ZYMO e o 
controle  sem  plasmídeo]  serem  transformadas  por  eletroporação,  as  mesmas 
foram  incubadas  em  meio  RMG  durante  16  horas,  conforme  descrito  por 
Picataggio et al. (1996). Posteriormente, as três culturas foram plaqueadas (100 
µl de cada) em meio RMG agarizado (20 g/L), na temperatura de 30°C, durante 
7  dias.  Desta  forma,  clones  transformantes  resistentes  ao  antibiótico  foram 
crescidos  em  meio  RM,  adicionado  de  xilose  e  glicose  em  diferentes 
concentrações,  no  intuito  de  avaliar  e  aperfeiçoar  o  crescimento  bacteriano, 
conforme indicado no item 4.4.2 ao 4.5.  
No  seguinte,  as  colônias  isoladas  que  apresentaram  maior  produção  de 
biomassa  e  rápido  crescimento  nestes  substratos  foram  testadas  quanto  à 
produção  de  etanol  (item  4.4.2.1).  Na  figura  4.9  observa-se  a  linhagem  CP4 
após transformação genética, sob o aumento de 1000x. 

CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
99 
 
Figura 4.9. Microscopia da linhagem de Zymomonas mobilis CP4 recombinante 
(aumento de 1000x). 
4.4.1.5.  Meio de crescimento e manutenção 
O  meio  sintético  RM  (rich  medium)  foi  utilizado  nos  ensaios  de 
fermentação  com  a  linhagem  recombinante,  bem  como  para  produção  do 
inóculo, conforme descrito por Mohagheghi  et al. (2002), Zhang (2003) e Jeon et 
al.  (2005).  Os  meios  RMG,  RMX  e  RMGX  foram  utilizados  quando  a glicose,  a 
xilose  e  a  combinação  dos  dois  açúcares  foram  empregadas  como  fonte  de 
carbono,  respectivamente,  nas  concentrações  de  20  g/L  para  cada  açúcar 
(Tabela 4.8).  
Tabela 4.8. Composição do meio RM empregado na linhagem recombinante de 
Zymomonas  mobilis  CP4.  Onde:  RMG:  meio  RM  adicionado  de  20  g/L  de 
glicose;  RMX:  meio  RM  adicionado  de  20  g/L  de  xilose;  RMGX:  meio  RM 
adicionado de 20 g/L de glicose e 20 g/L de xilose; gli: glicose; xil: xilose. 
Componente 
Concentração  
Tetraciclina 
10 mg/L 
Extrato de Levedura 
10 g/L 
KH
2
PO
4
 
2 g/L 
Adição de glicose (RMG) 
20 g/L 
Adição de xilose (RMX) 
20 g/L 
Adição de glicose e xilose (RMGX) 
20  g/L de gli, 20 g/L de xil 
Adicionalmente,  as  colônias  recombinantes  foram  preservadas  de  forma 
semelhante  às  linhagens  nativas,  no  entanto,  o  meio  SDL  foi  substituído  pelo 
meio RMGX.  Conforme já sinalizado na literatura, Lawford et al. (2000), Song et 
al  (2005)  e  Zou  et  al.  (2012)  empregaram,  de  forma  semelhante,  10  mg/L  de 

CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
100 
tetraciclina,  assim  como  utilizaram  o  meio  RM  para  repiques  e  conservação  do 
microrganismo.  
4.4.2.  ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO 
A  tabela  4.9  apresenta  um  esquema  geral,  visando  facilitar  a 
compreensão  das  etapas  definidas  para  frascos  agitados  no  que  tange  à 
produção  de  etanol  por  Z.  mobilis  CP4  recombinante.  As  etapas  de  1-3 
representam os ensaios avaliando o consumo de glicose e xilose, a seleção de 
clones,  bem  como  o  processo  de adaptação  metabólica  em  meio  sintético; nas 
etapas  4  e  5  foram  desenvolvidas  estratégias  de  aclimatação  celular  e  os 
experimentos  utilizando  o  bagaço  de  cana  como  substrato  para  a  produção  de 
etanol através do processo SSCF. 
Tabela 4.9. Experimentos sequenciais avaliando o desempenho da bactéria 
Zymomonas mobilis recombinante frente à produção de etanol. 
Meio Sintético 
1  Ensaios preliminares avaliando o consumo de glicose e xilose; 
2  Seleção de clones que apresentassem maior produção de etanol, bem como 
crescimento de biomassa celular a partir de glicose e xilose;  
3  Estratégia  de  adaptação  metabólica  para  propagação  celular  em  meio 
sintético contendo diferentes concentrações de glicose e xilose; 
SSCF 
4  Estratégia  para  propagação  celular  em  meio  contendo  hidrolisado  ácido 
oriundo do bagaço de cana (aclimatação celular); 
  5  Desenvolvimento  de  um  processo  simultâneo  de  hidrólise  enzimática  de 
celulose e co-fermentação (SSCF);   
Onde: meio sintético (1-3); bagaço de cana (4-5) 
4.4.2.1.  Ensaios preliminares para avaliar o consumo de glicose e xilose 
em meio sintético por Z. mobilis geneticamente modificada 
Para  se  verificar/avaliar  a  capacidade  de  utilização  de  glicose  e  xilose, 
foram  realizados  experimentos  em  meios  quimicamente  definidos  com  a 
linhagem  recombinante  de  Z.  mobilis,  analisando-se  o  consumo  de  substrato, 
produção  de  etanol  e  crescimento  celular,  bem  como  as  variáveis  de  resposta 
dos cultivos.  
Estes experimentos foram realizados em frascos cônicos de 500 mL com 

CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
101 
200  mL,  na  temperatura  de  30
o
C,  sem  agitação  orbital,  em  meio  sintético 
contendo glicose e xilose, separadamente e associadamente, nas concentrações 
de  1,3  a  20  g/L,  sendo  as  concentrações  dos  outros  nutrientes  descritas 
anteriormente na tabela 4.9.  
A  tabela  4.10  apresenta  o  planejamento  experimental  de  superfície  de 
resposta  2
2
,  com  5  repetições  do  ponto  central,  totalizando  13  experimentos, 
onde  as  concentrações  de  glicose  e  xilose,  em  meio  sintético,  foram  os 
parâmetros  analisados.  Adicionalmente,  os  valores  dos  demais  nutrientes, 
extrato de levedura e KH
2
PO
4
,  juntamente com a tetraciclina, foram fixados em 
10 g/L, 2g/L e 10 mg/L, respectivamente.  
Tabela 4.10. Variáveis independentes do planejamento experimental, avaliando 
diferentes  concentrações  de  glicose  e  xilose,  em  g/L,  quanto  à  produção  de 
etanol por Z. mobilis recombinante.  
 
I. 
Seleção de clones  
Após  a  realização  de  ensaios  em  estado  estacionário  (sem  agitação), 
priorizando  o  crescimento  celular,  diferentes  clones  foram  testados  quanto  à 
produção de etanol e de biomassa a partir do meio RMGX, em frascos agitados, 
sob 150 rpm de agitação e temperatura de 30
○
C. 
II. Adaptação Metabólica
 
 
O  processo  de  adaptação  metabólica  para  otimizar  a  fermentação  de 
xilose  foi  empregado  por  diversos  autores,  tais  como  Zhang  et  al.  (2002), 
Viitanen  et  al.  (2008)  e  Agrawal  et  al.  (2011),  uma  vez  que  linhagens 
recombinantes 
de 
Zymomonas 
mobilis 
apresentam 
dificuldades 
de 
metabolização deste açúcar. Desta forma, essa técnica consiste na aclimatação 
do  microrganismo à  xilose através de repiques sucessivos em  meios contendo, 
inicialmente,  elevadas  concentrações  de  glicose  e  reduzidas  de  xilose;  na 
 
PARÂMETROS 
Níveis 
-

 
- 
0 
+ 
+

 
A 
Glicose (g/L) 
1,3 
4 
10,5 
17 
19,7 
B 
Xilose 
 
(g/L) 
1,3 
4 
10,5 
17 
19,7 

CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
102 
medida  em  que  os  ciclos  de  repiques  são  realizados,  as  concentrações  da 
pentose se elevam e da hexose são reduzidas.  A tabela 4.11 indica que foram 
realizados  50  ciclos,  no  total de  160  dias,  a partir  de  combinações  variando  de 
1,5 a 15 g/L de glicose e 5 a 18,5 g/L de xilose; sendo que o KH
2
PO4 e o extrato 
de levedura,  componentes  do  meio  RM,  assim  como  a  tetraciclina,  mantinham-
se em 2 g/L, 10 g/L e 10 mg/L, respectivamente .   
Tabela 4.11. Processo de adaptação metabólica mediante 50 ciclos sucessivos, 
variando as concentrações de glicose e xilose em meio sintético.  
Ciclos 
Tempo (Dias) 
Glicose (g/L) 
Xilose (g/L) 
1-10 
70 
15 
5 
11-19 
30 
10 
10 
20-25 
20 
7,5 
13,5 
26-30 
15 
5 
15 
31-40 
15 
2,5 
17,5 
41-50 
10 
1,5 
18,5 
4.4.2.2. Ensaios para produção de etanol a partir de bagaço de cana através 
do processo SSCF 
 
Após  etapa  de  pré-hidrólise  enzimática,  as  células  bacterianas  foram 
inoculadas  no  meio  de  fermentação  (hidrolisado  hemicelulósico  e  celulósico) 
para  produção  de  etanol  através  do  processo  SSCF  (Simultaneous 
Saccharification and Co-Fermentation). 
I.   Adaptação Metabólica 
A tabela 4.12 indica que foram realizados 25 ciclos adaptativos sucessivos, 
no total de 90 dias, a partir de 2,5 a 10% de hidrolisado ácido do bagaço de cana 
adicionado  no  meio  RMG,  no  intuito  de  tornar  a  bactéria  recombinante  mais 
resistente a inibidores resultantes dos pré-tratamentos (descritos no item 2.5.3).