Ocorrente e recombinante, empregando

Tabela  4.12.  Processo  de  adaptação  metabólica  mediante  25  ciclos 
fermentativos,  variando  as  concentrações  de  hidrolisado  ácido  proveniente  do 
bagaço de cana e mantendo a concentração de glicose em 20 g/L.   
 
 
 
 
 
 
Ciclos 
Tempo  (Dias) 
Hidrolisado (%) 
1-5 
14 
2,5 
6-10 
20 
5 
11-15 
25 
10 
16-20 
20 
15 
21-25 
20 
20 

CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
103 
Conforme  descrito  por  Nghuyem  et  al.  (1996),  citado  no  item  2.8.4.5;  na 
medida  em  que  os  ciclos  de  repiques  sucessivos  são  realizados,  as 
concentrações de hidrolisado ácido se elevam e as de glicose são mantidas de 
acordo com o meio RMG.  
 
II.  Processo  de  propagação  mediante  diferentes  estratégias  de 
aclimatação celular 
Com  o  objetivo  de  investigar  o  efeito  da  aclimatação  celular  durante  a 
conversão de glicose e xilose oriundas das frações celulósicas e hemicelulósicas 
em  etanol,  respectivamente,  foram  utilizadas  quatro  diferentes  estratégias  de 
propagação  celular  para  obtenção  do  inoculo  a  ser  adicionado  nos  frascos  e 
posterior execução do processo SSCF.  
Cabe  ressaltar  que  ensaios  prévios  avaliando  a  adição  de  diferentes 
concentrações  de  hidrolisado  (5%,  10%,  20%,  30%,  40%)  em  meio  sintético 
complementar,  baseados  nos  estudos  de  Borges  (2011)  levaram-nos  a 
estabelecer  as  concentrações  empregadas  no  processo  de  aclimatação.  Todo 
processo  de  aclimatação  foi  desenvolvido  a  partir  de  um  pré-inóculo  inicial, 
crescido  em  meio  RMGX;  sendo  que  todas  as  etapas  posteriores,  descritas  a 
seguir, foram realizadas em meio RMG, uma vez que a xilose presente no meio 
sintético foi substituída pela xilose oriunda da fração hemicelulósica.  
a. Sem  aclimatação:  a  propagação  celular  ocorreu  usando  meio  sintético 
RMGX  sem  aclimatação;  em  seguida,  10%  (v/v)  do  meio  fermentado 
anteriormente  durante  48  h  foram  transferidos  para  o  meio  RMG  contendo 
10% de hidrolisado. As três etapas seguintes referem-se ao procedimento de 
aclimatação celular em meio contendo hidrolisado; 
b. Duas  etapas  (Estratégia  1-  aclimatação  de  5%  a  10%  de  hidrolisado):  a 
propagação  celular  ocorreu  em  um  frasco  cônico  com  200  mL  de  meio 
contendo  5%  de  hidrolisado;  posteriormente  10%  (v/v)  do  meio  fermentado 
anteriormente durante 48 h foram transferidos para o meio contendo 10% de 
hidrolisado; 
c. Duas  etapas  (Estratégia  2-  aclimatação  de  5%  a  20%  de  hidrolisado):  a 
propagação  ocorreu  em  um  frasco  cônico  contendo  5%  de  hidrolisado  em 

CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
104 
meio; posteriormente 10% (v/v) do meio fermentado anteriormente durante 48 
h foram transferidos para o meio contendo 20% de hidrolisado;  
d. Três  etapas  (Estratégia  3-  aclimatação  inicial  de  5%  e  10%,  seguida  da 
propagação em 20% de hidrolisado e posterior centrifugação): esta estratégia 
foi desenvolvida  após  as  aclimatações  descritas  anteriormente,  ou  seja,  dois 
diferentes  frascos  cônicos  contendo  200  mL  de  meio  RMG  com  diferentes 
concentrações de hidrolisado, 5% e 10%, foram inoculados em meio contendo 
20%  de  hidrolisado,  com  10%  (v/v)  do  meio  fermentado  anteriormente. 
Porém,  em  seguida,  as  culturas  foram  centrifugadas  (4000  rpm/10  min), 
atingindo a concentração de aproximadamente 4,0 g/L e, então, ressuspensas 
no meio de fermentação contendo 20% de hidrolisado (Figura 4.10).  
 
Figura  4.10.
  Diagrama  de  blocos  indicando  a  estratégia  empregada  para  aclimatação 
celular,  a  qual  envolve  3  etapas:  inóculos  em  meio  RMG  adicionado  de  5%  e  10%  de 
hidrolisado hemicelulósico;  seguidos  de  crescimento  em  meio  RMG  adicionado de 20% 
de  hidrolisado  hemicelulósico;  e  posterior  concentração  de  células  através  de 
centrifugação, a serem inoculadas na proporção definida de RMG adicionado de 20% de 
hidrolisado  hemicelulósico.  Onde:  (a)  pré-inóculo  crescido  em  meio  RMGX;  (b)  inóculo 
crescido  em  meio  RMG,  contendo  5%  (v/v)  de  hidrolisado  hemicelulósico;  (c)  inóculo 
crescido  em  meio  RMG,  contendo  10%  (v/v)  de  hidrolisado  hemicelulósico;  (d) 
concentração  de  células  (4000  rpm,  10  minutos),  atingindo  4  g/L;  (f)  ressuspensão  em 
meio RMG, contendo 20% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico.  
III.  Avaliação  da  produção  de  etanol  a  partir  do  processo  SSCF 
através de planejamentos experimentais sequenciais 
O processo foi desenvolvido em frascos 
cônicos de 500 mL contendo 200 
mL de meio de fermentação, que apresentava a mesma composição do meio de 
propagação, com exceção da adição de glicose e xilose, que foram substituídas 
pelo hidrolisado da celulose e da hemicelulose provenientes do bagaço de cana, 
respectivamente, ricos nestes açúcares.  

CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
105 
As  fermentações  ocorreram  nas  seguintes  condições:  12  horas  de  pré-
hidrólise  enzimática,  10%  (v/v)  de  inoculo  (aclimatado  segundo  a  estratégia 
citada  anteriormente  que  resultou  em  melhores  resultados  de  produção  de 
biomassa  celular),  temperatura  de  30
o
C,  agitação  de  150  rpm,  suplementação 
com  meio  RM,  bem  como  diferentes  concentrações  de  sólidos  e  hidrolisado 
hemicelulósico  do  bagaço  de  cana.  Tais  concentrações  foram  avaliadas  de 
acordo  com  a  execução  de
 
dois  planejamentos  experimentais  compostos 
centrais 2
2
, visando buscar por valores ótimos de produção de etanol através do 
processo SSCF (Tabelas 4.13 e 4.14). 
Tabela  4.13.  Variáveis  independentes  do  primeiro  planejamento  experimental: 
percentual  de  hidrolisado  hemicelulósico  e  relação  sólido:líquido  (g:mL)  do 
bagaço de cana, avaliando a produção de etanol pelo processo SSCF 1.  
 
PARÂMETROS 
Níveis 
-

 
- 
0 
+ 
+

 
A 
Hidrolisado (%) 
9,6 
20 
45 
70 
80,4 
B 
Sólido:líquido (g/mL) 
0,8 
1 
1,5 
2 
2,2 
 
 
Tabela  4.14.  Variáveis  independentes  do  segundo  planejamento  experimental 
avaliando  o  percentual  de  hidrolisado  ácido, bem  como  a  relação  sólido:líquido 
(g:mL)  do  bagaço  de  cana  no  que  tange  à  produção  de  etanol  pelo  processo 
SSCF 2. 
 
PARÂMETROS 
Níveis 
-

 
- 
0 
+ 
+

 
A 
Hidrolisado (%) 
0,7 
6,5 
20,5 
34,5 
40,3 
B 
Sólido:líquido (g/mL) 
1,01:10  1,3:10 
2:10 
2,7:10 
2,99:10 
4.5.  PRODUÇÃO  DE  ETANOL  EM  BIORREATOR  INSTRUMENTADO 
ATRAVÉS DOS PROCESSOS SSF E SSCF 
Os  ensaios  em  biorreator  (BIOFLO  III,  New  Brunswick)  foram  realizados 
após  a  determinação  das  melhores  condições  estabelecidas  nos  experimentos 
em  frascos  agitados,  utilizando-se  células  crescidas  (No  processo  SSF,  as 
células  foram  centrifugadas;  no  SSCF,  as  células  foram  adicionadas  na 
proporção de 10% v/v) (Figura 4.11).  
O volume nominal e de trabalho do biorreator instrumentado é de 1,5 litros 
e 500 mL, respectivamente, velocidade de agitação de 150 rpm, temperatura de 

CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
106 
30°C  e  pH  5,  sendo  monitorado  através  de  um  eletrodo  de  pH  esterilizado  e 
controlado pela adição de KOH 1M.  
 
Figura 4.11. Experimento em biorreator BIOFLO III (New 
.
Brunswick). 
4.6.  MÉTODOS ANALÍTICOS  
4.6.1.  DETERMINAÇÃO DE ETANOL E AÇÚCARES POR CLAE 
Em  todos  os  experimentos  foram  retiradas  alíquotas  de  2  mL,  com  rigor 
asséptico,  em  média,  a  cada  três  horas.  No  decorrer  dos  experimentos,  tais 
amostras foram devidamente tratadas através de centrifugação (11300  g por 10 
minutos),  filtradas  em  membrana  de  acetato  de  celulose  0,22  µm  e 
adequadamente diluídas para quantificação por CLAE (Figura 4.12).  
 
Figura 4.12. Sistema cromatrográfico CLAE com detecção por índice refração.  

CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
107 
Foram  determinadas  as  concentrações  de  glicose,  celobiose  e  etanol, 
utilizando o sistema cromatográfico (WATERS) composto por uma coluna HPX-
87P  (Bio-Rad),  operante  a  80°C  com  fluxo  de  0,6  mL/min  de  fase  móvel  (água 
MILLIQ),  bomba  WATERS  510,  detector  de  índice  de  refração  WATERS  410 
com  software  Empower.  Os  padrões  de  glicose,  celobiose  e  etanol  foram 
utilizados nas concentrações de 5 g/L, 10 g/L e 15 g/L, respectivamente. 
4.6.2.  QUANTIFICAÇÃO DO MICRORGANISMO  
O meio contendo a massa celular, após centrifugação em microcentrífuga 
(UNIVERSAR  IGR  HETTICH)  a  11.300g/min,  foi  separado  da  massa  celular.  O 
sedimentado  foi  posteriormente  ressuspendido  em  água  destilada  e  as  células 
quantificadas 
pela 
medida 
da 
absorbância 
em 
espectrofotômetro 
(SPECTRUMLAB  22PC)  a  600  nm,  segundo  Leal  (1998).  As  absorbâncias
 
medidas  foram  correlacionadas  com  os  valores  de  massa  seca  de  células 
através  das  curvas-padrão  apresentadas  na  tabela  4.15.  A  determinação  da 
massa seca de células foi feita após filtração em membrana Millipore (0,22 

m), 
seguida de secagem em balança de infravermelho (Sartorius- LJ16) e pesagem 
até massa constante. 
Tabela  4.15.  Curvas  padrão  de  absorbância  versus  concentração  da  massa 
celular para as linhagens de Z. mobilis. 
LINHAGEM 
CORRELAÇÃO 
Z. mobilis AG11 nativa 
Abs = 2,875 * concentração celular (R²= 0,992) 
Z. mobilis CP4 nativa 
Abs = 1,959 * concentração celular (R²= 0,994) 
Z. mobilis CP4 Recombinante
1
  
Abs = 4,016 * concentração celular (R²= 0,923) 
Z. mobilis CP4 Recombinante
2
 
Abs = 2,608* concentração celular (R²= 0,923) 
Onde: 1. Sem adaptação metabólica; 2. Após 26 ciclos adaptativos. 
 
4.7
.     
ANÁLISE DOS RESULTADOS 
4.7.1. ESTATÍSTICA  
Os  efeitos  estimados  das  variáveis  e  condições  de  processo  sobre  a 
concentração  final  de  etanol  (variável  de  resposta)  foram  analisados  em  um 
intervalo  de  90%  de  confiança,  mediante  a  Análise  de  Variância  (ANOVA)  e 
Metodologia  de  Superfície  de  Resposta,  através  do  Software  Design  Expert 
Software (versão 7.1.6. Stat-Ease, Inc., Minneapolis, EUA). 

CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
108 
 
4.7.2. CÁLCULO DE EFICIÊNCIA  
A eficiência de produção de etanol é medida de acordo com a quantidade 
de etanol produzido/1 g de substrato consumido (expressos em porcentagem), a 
partir do valor de Y
p/s
 teórico.  
 
Cálculo de eficiência:   
     
100
)
(
)
(
/
/
x
teórico
Y
processo
Y
E
S
P
S
P
f

                          
 
4.7.3. TAXA INSTANTÂNEA ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO 
Durante  o  intervalo  de  tempo  (dt),  o  aumento  de  números  de 
microrganismos  (dx),  na  fase  exponencial,  onde  as  células  absorvem  os 
nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando, pode ser 
representado por: 
          
X
μ

dt
dX
  

  
dt
dX
.
X
1

μ
   

   
 



T
dt
LnX
d.
μ
             (Equação 4.2) 
Onde: 
μ
 é a taxa específica de crescimento por unidade de tempo = 
μ
x
 
(taxa  específica  de  crescimento,  na  fase  exponencial).  Ao  plotar  o  gráfico  Ln  X 
versus  Tempo,  a  tangente  a  cada  ponto  da curva  obtida  fornece  o  valor  de 
μ
, 
durante a fase exponencial de crescimento. Analogamente, as taxas específicas 
para formação de produto e consumo de substrato, em g/g.h, são representados 
por: 
dt
dP
.
X
q
p
1

              e            
dt
dS
.
X
q
s
1


              (Equação 4.3) 
Os valores das taxas de crescimento celular (r
x
), de consumo de substrato 
(r
g
), formação de produto (r
p
) foram obtidas plotando-se a concentração celular, 
substrato ou produto com o tempo.  
(Equação 4.1) 

CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
109 
 
4.7.4. TEMPO DE DUPLICAÇÃO 
Tempo  de  geração  (tg)  que  é  o  tempo  de  duplicação  da  massa  celular 
pode ser representado por: 
Ln 2X
0
/X
0
 = 

x
 t
g 
   

    t
g
 = Ln 2 /

x  
  

    t
d 
= 0,693/ 

x                
            
               (Equação 4.4)       
 
4.7.5. VARIÁVEIS DE RESPOSTA 
Os parâmetros próprios de processos de fermentação foram considerados 
da seguinte forma:  
a) Fator de rendimento de produção de etanol (g/g) 
 
Sendo:     
P:
  
Concentração final de etanol (g/L) 
P
o
:
  
Concentração inicial de etanol (g/L) 
S
: 
Concentração final de substrato (g/L) 
S
o
:
 
Concentração inicial de substrato (g/L) 
 
b) Fator de rendimento para crescimento celular (g/g)  
 
Sendo:     
X:
 
Concentração final de biomassa (g/L) 
 
 
X
o
:
 
Concentração inicial de biomassa (g/L) 
S:
 
Concentração final de substrato (g/L) 
S
o
:
 
Concentração inicial de substrato (g/L) 
 
c) Produtividade volumétrica (g/L.h) 
 
Sendo:    
 P:
 
Concentração final de etanol (g/L) 
 
 
P
o
:
 
Concentração inicial de etanol (g/L) 
t
f
:
 
Tempo de fermentação (h) 
                 (Equação 4.7) 


f
o
P
t
P
P
Q


               (Equação 4.6) 

 
 

S
S
X
X
S
X
Y
o
o
S
X







/

 
 

S
S
P
P
S
P
Y
o
o
S
P







/
                                                               
(Equação 4.5) 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
110     
                                                             
_____________________CAPÍTULO 5 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
O  presente  capítulo  foi  destinado  à  exposição  e  discussão  dos 
resultados  referentes  às  linhagens  de  Zymomonas  mobilis  naturalmente 
ocorrentes,  assim  como  a  modificada  geneticamente.  Tais  resultados  foram 
obtidos a partir da conclusão dos experimentos planejados para elaboração da 
tese.  Nos  estudos  sobre  a  otimização  dos  parâmetros  operacionais  foram 
desenvolvidos  planejamentos  experimentais  sequenciais  e  os  efeitos  de 
impacto sobre a variável de resposta foram analisados a partir de metodologias 
de  superfície  de  resposta,  definindo  as  condições  ótimas  para  a  condução  do 
processo.  

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
111     
5.1.   ENSAIOS  DE  FERMENTAÇÃO  EMPREGANDO  A  BACTÉRIA 
Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE
 
5.1.1.  Desempenho das  linhagens nativas  frente  à  utilização de glicose  e 
xilose  
Visando  avaliar  a  capacidade  de  consumo  dos  principais  açúcares 
encontrados  nas  frações  polissacarídicas  de  resíduos  de  composição 
lignocelulósica,  nomeadamente  glicose  e  xilose,  realizou-se  um  ensaio,  em 
meio sintético, com as duas linhagens de Z. mobilis.  
Os  perfis  cinéticos  que  representam  o  desempenho  de  ambas  as 
linhagens estão apresentados nas figuras que se seguem. Analisando o gráfico 
da  cinética  de  Z.  mobilis  AG11  (Figura  5.1),  observa-se  que  o  substrato  foi 
consumido em um período de 15 horas. O desempenho da linhagem Z. mobilis 
CP4  foi  similar,  no  entanto,  o  tempo  para  o  consumo  total  da  glicose  foi 
ligeiramente superior (18 horas) (Figura 5.2).  
 
Figura 5.1. Cinética de consumo de glicose, produção de etanol e crescimento 
celular pela linhagem de Z. mobilis AG11. 
 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
112     
 
Figura 5.2. Cinética de consumo de glicose, produção de etanol e crescimento 
celular pela linhagem de Z. mobilis CP4. 
Conforme  sinalizado  pela  literatura,  células  de  Z.  mobilis  apresentam 
reduzido crescimento, destinando grande parte do substrato para a síntese de 
etanol;  contudo,  observa-se,  em  ambas  as  linhagens,  uma  associação  do 
crescimento celular com a produção de etanol. Rogers  et al. (1982) já haviam 
reportado que apenas 2% do carbono encontrado na molécula do substrato são 
convertidos à plasticidade celular.  
As  variáveis  medidas  e  calculadas  desta  série  de  experimentos  foram 
reunidas e estão apresentadas na tabela 5.1.  
Tabela  5.1.  Desempenho  das  linhagens  AG11  e  CP4  de  Z.mobilis  na 
fermentação de glicose (concentração inicial de 20 g/L). 
Variáveis medidas e calculadas 
AG11 
CP4 
Etanol (g/L) 
7,5 
6,3 
Células (g/L) 
0,48 
0,43 
Produtividade (g/L.h) 
0,50 
0,33 
Taxa específica de crescimento (h
-1
) 
0,147 
0,169 
Fator de conversão em produto (Y
P/S
), em g.g
-1 
0,255 
0,106 
Fator de conversão em células (Y
X/S
), em g.g
-1
 
0,024 
0,019 
Eficiência de fermentação (%) 
54 
22 
Tempo de duplicação (h) 
4,7 
4,1 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
113     
Pode-se  constatar,  que  em  meio  sintético,  ambas  as  linhagens 
apresentaram  resultados  semelhantes  quanto  à  produção  de  etanol  e 
crescimento  celular.  Embora,  a  linhagem  AG11  tenha  apresentado  valores 
ligeiramente  superiores  de  produtividade  volumétrica  e  fatores  de  conversão 
tanto de células quanto de produto, a linhagem CP4 exibiu valor superior para a 
taxa específica de crescimento.  
Na  Figura  5.3  observa-se  um  cromatograma  típico  de  início  de 
fermentação  por  Z.  mobilis  CP4,  no  qual  a  glicose  apresenta-se  em  altas 
concentrações  e  a  produção  de  etanol  é  iniciada,  verificando-se,  ainda,  a 
presença de alguns subprodutos.  
 
Figura 5.3. Perfil cromatográfico típico da fermentação por Z.mobilis.  
No  tocante  ao  consumo  de  xilose,  foi  constatada  a  incapacidade  de 
ambas  as  linhagens  nativas  em  metabolizar  esta  pentose.  Não  houve 
crescimento  celular,  assim  como  não  houve  produção  de  etanol,  conforme 
mostrado na figura 5.4.