Ocorrente e recombinante, empregando

Figura 5.4. Desempenho de Z. mobilis AG11 (A) e CP4 (B) em xilose. 
g
lic
o
s
e
 -
 1
1
,7
0
5
1
2
,7
1
2
e
ta
n
o
l 
- 
1
5
,9
0
7
1
8
,9
6
2
2
3
,7
1
5
3
6
,9
4
6
3
7
,0
6
7
3
7
,1
5
0
mV
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
Minutes
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
30,00
32,00
34,00
36,00
38,00
40,00

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
114     
Como  colocado  anteriormente,  este  ensaio  se  mostrou  de  suma 
importância,  pois  permitiu  definir  a  estratégia  para  a  produção  de  etanol  de 
segunda  geração;  levando-se,  inicialmente,  a  optar  pelo  aproveitamento 
apenas da fração celulósica pelas linhagens nativas, através da concepção de 
hidrólise enzimática simultânea à fermentação alcoólica. 
5.1.2.  Otimização  do  processo  de  hidrólise  enzimática  simultânea  à 
fermentação alcoólica por Zymomonas mobilis CP4 
I. 
Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado 
Visando-se  definir  uma  condição  que  resultasse  em  elevadas 
concentrações  de  etanol  a  partir  do  processo  SSF,  um  planejamento 
experimental 2
3
, empregando o método de superfície de resposta, foi realizado. 
A matriz experimental está apresentada na tabela 5.2, a qual contém os valores 
das  condições  empregadas,  avaliando  a  concentração  de  células,  carga 
enzimática  e  relação  sólido:líquido  do  bagaço  pré-tratado  (g:mL);  assim  como 
as respectivas respostas (concentração de etanol e produtividade volumétrica).  
Os ensaios foram conduzidos de acordo com a metodologia descrita na 
seção  4.3.3.2,  empregando-se  o  processo  de  hidrólise  enzimática  da  celulose 
simultânea à fermentação, com um tempo de pré-hidrólise enzimática de 12 h. 
Na  figura  5.5  A,  observa-se  a  celulignina  de  bagaço  de  cana-de-açúcar  pré-
tratada e submetida a lavagens com água destilada e secagem, sem a adição 
de meio e de enzimas, que se apresenta em estado sólido.  
Na sequência, adicionou-se meio de cultivo, descrito no item 4.3.2, com 
exceção  da  glicose,  carga  enzimática  de  25  FPU/g,  como  preconizado  por 
Vásquez  (2007
), 
e  relação  sólido:líquido  de  3:10  (g:mL)  (Fig.  5.5.  B).  Após  o 
pré-tratamento  enzimático  o  material  sólido  hidrolisado  foi  liquefeito,  atingindo 
cerca de 80 g/L de glicose, tornando-o próprio para a fermentação (Fig. 5.5. C).  
Observa-se  que  as  maiores  concentrações  de  etanol  foram  obtidas  para  as 
mais elevadas relações sólido:líquido, a exceção do experimento 4, no qual se 
utilizou  a  carga  enzimática  em  seu  valor  mínimo.  Conforme  reportado  por 
Vásquez  (2007),  a  relação  sólido:  líquido  e  a  carga  enzimática  são  fatores 
essenciais  para  a  otimização  do  processo  SSF,  uma  vez  que  o  aumento  no 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
115     
teor  de  sólidos  associado  ao  aumento  da  carga  enzimática  resultou  em  um 
aumento nas concentrações de etanol. 
Tabela  5.2.  Planejamento  Experimental  de  Superfície  de  Resposta  2
3
, 
avaliando  a  relação  sólido:líquido,  carga  enzimática  e  concentração  celular 
frente à produção de etanol a partir do bagaço de cana pré-tratado através do 
processo SSF por Z. mobilis CP4.  
 
Ex. 
Condições 
Respostas 
S:L 
(g:L) 
CE 
(FPU/g) 
X
o 
(g/L) 
Glicose 
(g.L
-1
) 
Etanol 
(g.L
-1
) 
Q
P 
(g/L.h) 
1 
0,32:10 
17,5 
2,5 
12,3 
6,5 
0,23 
2 
2:10 
17,5 
5,02 
70,7 
35,2 
1,49 
3 
2:10 
17,5 
2,5 
69,9 
33,8 
1,42 
4 
3:10 
10,0 
4,0 
33,8 
13,7 
0,5 
5 
2:10 
17,5 
2,5 
69,9 
33,8 
1,45 
6 
3:10 
10,0 
1,0 
35,5 
14,9 
0,5 
7 
1:10 
10,0 
1,0 
17,2 
5,9 
0,2 
8 
3:10 
25,0 
4,0 
80,3 
60,7 
1,52 
9 
2:10 
17,5 
2,5 
70,5 
30,6 
1,38 
10 
2:10 
17,5 
2,5 
69,5 
33,4 
1,42 
11 
1:10 
10,0 
4,0 
20,1 
13,4 
0,41 
12 
1:10 
25,0 
1,0 
26,3 
14,7 
0,85 
13 
1:10 
25,0 
4,0 
33,8 
17,9 
0,88 
14 
2:10 
30,11 
2,5 
76,6 
36,8 
0,94 
15 
3:10 
25,0 
1,0 
80,7 
48,7 
0,98 
16 
2:10 
17,5 
0,02 
50,5 
6,9 
0,06 
17 
3,68:10 
17,5 
2,5 
10,6 
6,2 
0,42 
18 
2:10 
17,5 
2,5 
70,6 
29,1 
1,41 
19 
2:10 
4,89 
2,5 
12,8 
5,4 
0,21 
20 
2:10 
17,5 
2,5 
70,6 
34,9 
1,39 
  Onde: S:L: relação sólido:líquido, CE: carga enzimática, Q
P=
 produtividade 
volumétrica, X
0
=concentração celular.  
 
 
Figura 5.5. Material celulósico deslignificado (A), logo após a adição de 
enzimas e meio (B) e após a pré-hidrólise enzimática (C).    
 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
116     
A  significância  estatística  das  equações  do  respectivo  modelo  foi 
verificada utilizando-se o teste de Fisher da análise de variância (ANOVA). No 
tocante  à  concentração  inicial  de  glicose,  o  modelo  quadrático  reduzido  foi  o 
melhor  modelo  ajustado  para  o  processo  (após  pré-hidrólise  enzimática),  pois 
apresentou o maior valor de R
2
 (0,8884).  
Na  tabela  5.3,  observa-se  que  o  Lack  of  Fit  é  apresentado  como 
significativo  (p<0,05),  embora  o  modelo  tenha  permanecido  significativo  (p-
valor  inferior  a  0,0001),  não  sendo  invalidado.  O  Parâmetro  C  (concentração 
celular)  e  suas  interações  foram  removidos  do  modelo,  uma  vez  que  não 
apresentam influência na liberação de glicose, pois esta é produzida durante a 
pré-hidrólise  enzimática,  ou  seja,  antes  da  inoculação  da  bactéria.  Por  este 
motivo,  provavelmente,  o  Lack  of  Fit  mostrou-se  significativo.  O  parâmetro  B 
(carga enzimática) foi o mais influente na liberação de glicose, pois apresentou 
os maiores valores de soma dos quadrados e de média quadrática, seguido do 
parâmetro A (relação sólido:líquido) e logo, da interação AB.  
Tabela 5.3. Análise de variância da concentração de glicose inicial do processo 
SSF  a  partir  do  bagaço  de  cana  pré-tratado  por  Z.  mobilis  CP4,  através  do 
Planejamento Experimental de Superfície de Resposta  2
3
, avaliando a relação 
sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular. 
                 
    SQ               GL             MQ                   F                  p >F       
Modelo        1694,875            5 
2338,97        
22,29 
< 0,0001 
A  
1313,64 
1 
1313,64 
12,52 
0,0033 
B  
3460,54 
1 
3460,54 
32,98 
< 0,0001 
A
2
 
5681,33 
1 
5681,33 
54,15 
< 0,0001 
B
2
 
944,23 
1 
944,23 
9,00 
0,0096 
AB 
662,48 
1 
662,48 
6,31 
0,0248 
Resíduo 
1468,91  
14 
104,92 
 
 
Lack of Fit  1467,84 
9 
163,09 
759,75 
< 0,0001 
Erro 
1,07 
5 
0,21 
 
 
Cor Total  13163,78 
19 
 
 
 
[Glicose]: [R
2
 = 0,8884, R
2
 Aj = 0,8486] 
Onde,  SQ=  Soma  Quadrática,  GL=  Grau  de  Liberdade,  MQ=  Média 
Quadrática, F= Fisher Calculado, p >F= Probabilidade de Fisher. 
A= relação sólido:líquido, B= carga enzimática, C= concentração celular. 
O  modelo  de  glicose  resultante  após  a  pré-hidrólise  enzimática  é 
representado pela seguinte equação (1): 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
117     
[Glicose] = -69.28050+67.60248 A+4.70742 B+1.21333 AB-19.75705 A
2
-
0.14319B
2
                                          
 
 
 (1)                                                                              
Os gráficos 3-D de superfície de resposta representam as equações de 
regressão, mostrando a interação entre relação sólido:líquido, carga enzimática 
e  concentração  celular  para  a  concentração  final  etanol,  produtividade 
volumétrica e  concentração inicial  de  glicose  do  processo  SSF.  Na  figura  5.6, 
observa-se  o  contorno  de  superfície  resposta  para  a  otimização  da 
concentração inicial de glicose do SSF. Os efeitos da relação sólido:líquido (A) 
e carga enzimática (B) indicam que a concentração de glicose do  SSF é maior 
nos  maiores  níveis  de  carga  enzimática  e  na  maior  relação  sólido:líquido, 
obviamente,  pois  quanto  maior  for  o  conteúdo  sólido  e  maior  for  a  carga 
enzimática, maiores concentrações de açúcares serão liberadas no processo.  
 
Figura  5.6.  Superfície  de  resposta  mostrando  os  efeitos  combinados  da 
relação sólido:líquido (parâmetro A) e  carga enzimática (parâmetro B) sobre a 
concentração  inicial  de  glicose  do  processo  SSF  a  partir  do  bagaço  de  cana 
pré-tratado. 
 
   
No que concerne à  concentração de etanol, o modelo utilizado para a 
avaliação foi o Cúbico Reduzido, uma vez que  apresentou maior valor para R
2
 
(0,9926),  indicando  99,2%  de  ajuste  da  resposta.  Na  tabela  5.4.  observa-se 
que o modelo  manteve-se significativo, com valor de Fisher de 78,31 e Lack of 
Fit  não  significativo  (p>0,05).  A  probabilidade  de  p-valor  inferior  a  0,0001 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
118     
indicou  igualmente  que  o  modelo  foi  altamente  significativo  e  que  os  dados 
experimentais  obtidos  estão  em  um  bom  ajuste  com  o  modelo.  Todos  os  três 
parâmetros avaliados (relação sólido: líquido, carga enzimática e concentração 
célular)  foram  significativos  e  foram  mantidas  no  modelo.  Embora,  dentre  as 
três  interações  existentes,  apenas  a  interação  AB  (relação  sólido:  líquido 
associada  a  carga  enzimática)  foi  mantida  no  modelo,  apresentando-se  muito 
representativa (alto valor de Fisher). 
A equação do modelo é apresentada na equação (2):  
 [Etanol] = +32.60 +16.70 A+13.09 B+ 808.35 C
–
 9.28 A
2 
–
 4.07 B
2 
+ 4.48 C
 2 
+ 
8.44AB - 5.93 A
 3 
–
 1.33 B
3 
–
 287.21 C
3 
–
 516.46 A
2 
C + 2.19 ABC   (2) 
 Analisando  os  valores  de  soma  dos  quadrados  e  média  quadrática, 
observa-se  que  a  relação  sólido:líquido  (parâmetro  A)  teve  o  efeito  mais 
significativo,  seguida  pela  carga  enzimática  (parâmetro  B)  e,  finalmente,  a 
concentração celular (parâmetro C), que teve menor influência na concentração 
Tabela  5.4.  Análise  de  variância  da  concentração  de  etanol  através  do 
processo  SSF  a  partir  do  bagaço  de  cana  pré-tratado  por  Z.  mobilis  CP4, 
utilizando  o  Planejamento  Experimental  de  Superfície  de  Resposta  2
3
, 
avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular. 
                              SQ           GL             MQ                     F                       p >F 
Modelo 
4693,84 
12 
391,15                78,31 
<  0,0001 
A  
792,07 
1 
792,07 
158,58 
<  0,0001 
B  
486,79 
1 
486,79 
97,46 
<  0,0001 
C  
44,36 
1 
244,36 
48,92 
    0,0002 
A
2
 
1033,59 
1 
1033,59 
206,94 
<  0,0001 
B
2
 
198,37 
1 
198,37 
39,72 
    0,0004 
C
2
 
76,08 
1 
76,08 
15,23 
    0,0059 
AB 
569,53 
1 
569,53 
114,03 
<  0,0001 
A
3
 
390,22 
1 
390,22 
78,13 
<  0,0001 
B
3
 
19,52 
1 
19,52 
3,91 
    0,0886 
C
3
 
239,23 
1 
239,23 
47,90 
    0,0002 
A
2
C 
244,67 
1 
244,67 
48,99 
    0,0002 
ABC 
38,28 
1 
38,28 
7,66 
    0,0278 
Resíduo 
34,96 
7 
4,99 
 
 
Lack of Fit 
9,90 
2 
4,95                 0,99                  0,4350           
Erro Puro 
25,06 
5 
5,01 
 
 
Cor Total 
4728,80 
19 
 
 
 
[Etanol]:  [R
2
 = 0,9926, Adj R
2
 = 0,9 799] 
Onde,  SQ=  Soma  Quadrática,  GL=  Grau  de  Liberdade,  MQ=  Média 
Quadrática,  F=  Fisher  Calculado,  p  >F=  Probabilidade de Fisher.    A=  relação 
sólido:líquido, B= carga enzimática, C= concentração celular. 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
119     
de etanol. A interação entre carga enzimática e concentração celular (BC), bem 
como a interação entre relação sólido:líquido e concentração celular (AC) não 
tiveram  influência  significativa  na  presente  análise,  com  valores  de  p>F 
inferiores a 0,05, e, portanto, foram removidas do modelo.  
O  aumento  da  relação  sólido:líquido  associada  ao  aumento  da  carga 
enzimática  fez  com  que  a  eficiência  de  hidrólise  fosse  maior  e, 
consequentemente,  gerado  uma  maior  concentração  inicial  de  glicose 
disponível  no  meio.  Kim  et  al.  (2008)  analisaram  o  processo  de  fermentação 
SSF e, da mesma maneira, observou que a eficiência de fermentação depende 
da concentração inicial de glicose produzida durante a hidrólise enzimática.  
 
A figura 5.7 mostra que a máxima concentração de etanol ocorre quando 
a  relação  sólido:líquido  (A)  e  a  carga  enzimática  (B)  estão  em  seus  maiores 
níveis,  aumentando-se  significativamente  a  partir  do  ponto  central  dos  dois 
parâmetros analisados para os seus níveis mais elevados.  
 
Figuras  5.7.  Superfície  de  resposta  mostrando  os  efeitos  combinados  da 
relação sólido:líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro B) sobre a 
concentração  de  etanol  através  do  processo  SSF  a  partir  do  bagaço  de  cana 
pré-tratado por Z. mobilis CP4. 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
120     
Embora  exista  uma  tendência  para  uma  curvatura  no  gráfico  de 
superfície  de  resposta  referente  à  concentração  de  etanol,  o  valor  máximo  é 
claramente atingido, conforme plotado no gráfico de produtividade volumétrica, 
em que a curvatura é muito evidente. Analisando os resultados desta série de 
experimentos,  constata-se  que  a  hidrólise  foi  ineficiente  quando  a  carga 
enzimática e a relação sólido:líquido eram baixas, assim como quando haviam 
altas concentrações de sólidos associados à baixos níveis de carga enzimática, 
liberando  baixas  concentrações  de  glicose  ao  meio  e,  consequentemente, 
produzindo baixas concentrações de etanol. Portanto, a carga enzimática deve 
aumentar em associação à relação sólido:líquido. 
 
No  tocante  à  produtividade  volumétrica,  o  melhor  modelo  ajustado 
para  a  análise  estatística  desta  variável  de  resposta  também  foi  o  modelo 
cúbico  reduzido,  uma  vez  que  resultou  no  melhor  valor  de  R
2
  (0,8848). 
Segundo a análise da soma dos quadrados e média quadrática, o parâmetro B 
(carga enzimática) foi o mais influente, seguido do parâmetro C (concentração 
celular). O parâmetro A (relação sólido:líquido) foi o menos influente no modelo 
de produtividade volumétrica de etanol (Tabela 5.5).   
 
 
O  Lack  of  Fit  foi  mostrado  como  significativo  (p<0,05),  porém  não 
invalidou  o  modelo,  uma  vez  que  os  valores  preditos  estão  em  conformidade 
com  os  valores  experimentais.  O  modelo  hierárquico  foi  mantido,  com  os 
respectivos parâmetros e interações, visando uma maior análise do decorrer da 
fermentação através dos gráficos de superfície de resposta  (Figura 5.8). 
 
A  figura  5.8  representa  o  modelo  de  superfície  de  resposta  para  a 
otimização de produtividade volumétrica. O efeito da relação sólido:liquido (Fig. 
5.8  A)  e  carga  enzimática,  mantendo-se  a  concentração  celular  no  ponto 
central,  indica  claramente  que  o  ponto  ótimo  para  a  máxima  produtividade 
volumétrica é em torno do nível máximo de carga enzimática e do ponto central 
da relação sólido liquido. No entanto, quando o processo SSF ocorre em níveis 
elevados de sólidos, o tempo de fermentação e a concentração de  etanol são 
afetados,  sendo  reduzidos,  conforme  analisado  nos  experimentos  4,  6  e  17 
(Tabela  5.2).  Quando  há  um  aumento  no  conteúdo  de  sólidos  e  a  carga 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
121     
enzimática  não  aumenta  proporcionalmente,  a  hidrólise  enzimática  ocorre 
lentamente e, assim, a liberação de glicose no processo é baixa, reduzindo-se 
a  concentração  de  etanol  e  a  produtividade  volumétrica,  pois  a  taxa  de 
fermentação é limitada pela baixa concentração do substrato. 
 Tabela  5.5.  Análise  de  variância  da  produtividade  volumétrica  de  etanol 
através do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis 
CP4,  utilizando  o  Planejamento  Experimental  de  Superfície  de  Resposta  2
3
, 
avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular. 
 Onde,  SQ=  Soma  Quadrática,  GL=  Grau  de  Liberdade,  MQ=  Média 
Quadrática,  F=  Fisher  Calculado,  p  >F=  Probabilidade  de  Fisher,  A=  relação 
sólido:líquido, B= carga enzimática, C= concentração celular. 
 
 
 
O  efeito  das  interações  entre  a  relação  sólido:liquido  e  a  concentração 
celular (AC), mantendo-se a carga enzimática em seu ponto central, indica que 
a maior produtividade volumétrica ocorre nos níveis máximos de concentração 
celular e em torno do ponto central para a relação sólido: líquido. Desta forma, 
quando  a  relação  sólido:líquido  é  baixa,  a  liberação  de  glicose  no  processo  é 
igualmente  reduzida,  fazendo  com  que  baixas  concentrações  deste  açúcar 
sejam  disponíveis  no  meio  de  fermentação  e,  consequentemente,  com  que  a 
concentração de etanol e de produtividade volumétrica diminuam. Além disso, 
observou-se  que  quando  haviam  concentrações  elevadas  de  sólidos,  sem 
proporcional  aumento  de  carga  enzimática,  o  mesmo  não  era  hidrolisado  por 
completo,  mantendo-se  baixas  as  concentrações  de  glicose  disponíveis  no 
 
 
      SQ             GL               MQ                   F                      p >F 
Modelo              4,63 
10 
0,46                6,92                  0,0038 
A  
0,14 
1 
0,14 
2,11 
0,1800 
B  
1,14 
1 
1,14 
16,97 
0,0026 
C  
0,79 
1 
0,79 
11,85 
0,0074 
A
2
 
1,60 
1 
1,60 
23,96 
0,0009 
B
2
 
0,87 
1 
0,87 
12,94 
0,0058 
C
2
 
0,43 
1 
0,43 
6,47 
0,0315 
AB 
0,011 
1 
0,011 
0,16 
0,7011 
AC 
5,513E-003 
1 
5,513E-003 
0,082 
0,7806 
BC 
0,025 
1 
0,025 
0,38 
0,5538 
ABC 
0,050 
1 
0,050 
0,74 
0,4116 
Resíduo 
0,60 
9 
0,067 
 
 
Lack of Fit 
0,60 
4 
0,15 
242,90 
<0,0001 
Erro Puro   3,083E-003 
5 
6,167E-004 
 
 
Cor Total 
5,23 
19 
 
 
 
Produtividade Volumétrica:  [R
2
 = 0,8848, R
2
 Aj = 0,7569] 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
122     
meio,  conforme  os  experimentos  4,  6  e  17  (Tabela  5.2).  A  relação  sólido: 
líquido  em  seus  níveis  ótimos,  quando  associada  a  altas  concentrações  de 
células, proporcionou aumento de produtividade volumétrica de etanol.