Ocorrente e recombinante, empregando
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2.8.4. ALTERNATIVAS Visando minimizar o efeito da toxicidade destes compostos inibitórios nas células, muitos estudos utilizam diferentes linhagens para se obterem maiores rendimentos em etanol e produtividade volumétrica. Além disso, no que tange à melhoria do processo metabólico da xilose, existem algumas linhas de pesquisa que almejam contornar à problemática de conversão deste açúcar a etanol, conforme detalhado nos itens a seguir. 2.8.4.1. Linhagens adaptadas à toxicidade Técnicas de engenharia genética também vêm sendo utilizadas para a obtenção de microrganismos tolerantes a compostos inibitórios presentes no hidrolisado ácido, como furfural, acetato e lactato. A linhagem Z. mobilis ZM4, originada da ATCC31821 (JOACHIMSTHAL et al., 1998; YANG et al., 2009), assim como a CP4, foram isoladas do caldo de cana-de-açúcar; no entanto, comparativamente, a linhagem ZM4 apresenta melhor performance em etanol (ZOU et al., 2011). Joachimshtal & Rogers (2000) já haviam comparado a performance da linhagem ZM4 (pZB5) com a CP4 (pZB5), a partir de 65 g/L de xilose e 65 g/L de glicose, produzindo 62 g/L e 52 g/L de etanol, em 48 h e 60 h, respectivamente. Contudo, quando as concentrações de carboidratos se elevam para 75 g/L, a produção mantêm-se em 67 g/L pela linhagem ZM4. A espécie Z. mobilis ZM4 possui genes com importantes funções fisiológicas e metabólicas, dentre elas, a tolerância ao acetato de sódio na concentração de 12 g/L, em temperatura de 30 o C e pH (YANG et al., 2010), ao passo que a linhagem CP4 (pZB5) de Z. mobilis tolera até 9,3 g/L deste sal (RANATUNGA et al., 1997). Já Kim et al. (2000) reportaram que concentrações de 10,9 g/L de acetato de sódio afetaram significativamente a fermentação por tal espécie. Dentre outros compostos inibitórios, o crescimento de Z. mobilis ZM4 foi mais influenciado negativamente pela presença de vanilina, seguida de furfural e do HMF, atingindo completo crescimento (até a fase estacionária) em CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica Danielle da Silveira dos Santos 73 21, 19 e 16 horas, respectivamente, ao passo que na ausência destes, a linhagem cresce em 11 h de fermentação (YANG et al., 2010). Lawford et al. (2000) avaliaram a co-fermentação através de processo contínuo por uma linhagem recombinante de Z. mobilis (39676/ pZB4L), que apresenta boa performance no hidrolisado ácido de madeira. Os pesquisadores mostraram que 4 g/L de ácido acético não afetou o crescimento celular, que ocorreu com um fator de rendimento em biomassa de 0,030 g células/g dos açúcares, promovendo também um aumento do coeficiente de manutenção energética variando de 0,46-1,0 g carboidratos/g células.h. Por tolerar maiores concentrações deste composto, a conversão em produto por substrato consumido foi de 0,47 g/g, a partir de alterações na alimentação do processo de 4 a 3% (m/v) de xilose e de 0,8 a 1,8% (m/v) de glicose, assim como reportado por Lawford et al. (1999). Entretanto, quando houve variação do pH 6 para 5, a concentração de biomassa e a produtividade volumétrica reduziram em 12 e 32%, respectivamente, contudo, a conversão em etanol e a produção final foram inalteradas, atingindo a concentração de 24 g/L de etanol e 5 g/L de xilose residual, após 24 horas de fermentação. Estudos empregando a linhagem ZM4 transformada geneticamente através da inserção do gene AcR, que a atribui maior resistência ao acetato, apontam para a tolerância a este inibidor em concentrações de 20 g/L (JOACHIMSTHAL et al., 1998). Posteriormente, Jeon et al. (2002) empregaram esta linhagem recombinante (ZM4/Acr), inserindo, também, os genes de metabolização da xilose (pZB5). A nova bactéria recombinante passou a tolerar a presença de 12 g/L de acetato, a partir de 40 g/L de glicose e 40 g/L de xilose, atingindo 38,6 g/L de etanol e 7 g/L de xilose residual após 53 horas de processo. Recentemente, Zhang & Lynd (2011) reportam que a linhagem 8b tolera maiores concentrações deste inibidor, em até 16 g/L de ácido acético, atingindo 87 e 85% de eficiência de fermentação em etanol, em pH 6, nas temperaturas de 30 o C e 37 o C, respectivamente, a partir de meio contendo glicose, xilose e hidrolisado ácido do milho. CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica Danielle da Silveira dos Santos 74 2.8.4.2. Redução de cargas enzimáticas no processo SSCF Visando contornar as questões inibitórias do transporte de pentoses através do processo de hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas frente ao microrganismo Zymomonas mobilis recombinante, Olofsson et al. (2010) desenvolveram uma estratégia simplificada, que se baseava na adição de baixos níveis de celulases. Dessa forma, ocorria a liberação de baixas concentrações de glicose ao longo da fermentação, reduzindo a repressão catabólica por tal açúcar e possibilitando, assim, que o consumo de xilose aumentasse de 40 a 80%. 2.8.4.3. Modificação genética da glf Conforme relatado no item 2.8.3, Weisser et al. (1995), Kim et al. (2010), Agrawal et al. (2011), dentre outros autores, indicaram que células de Z. mobilis geneticamente transformadas possuem dificuldades metabólicas de consumir a xilose, sendo uma das hipóteses relacionada à possível competição entre esta pentose e a glicose frente à uma única proteína transportadora desses carboidratos. Neste contexto, algumas pesquisas investigam a transformação genética dos genes que codificam para as proteínas transportadoras, visando otimizar o desempenho de tal bactéria frente à inserção e fermentação da xilose. Recentemente, Ren et al. (2009) modificaram geneticamente o microrganismo E. coli, inserindo o gene codificador da proteína facilitadora do transporte dos carboidratos (glf) em Z. mobilis. Os autores inativaram genes responsáveis pela repressão catabólica em E. coli, promovendo o consumo de 42% de xilose. 2.8.4.4. Inativação da GFOR Viitanem et al. (2008) desenvolveram a linhagem ZW800, a qual possui reduzida produção de xilitol, através da inativação do gene que codifica para a GFOR, um dos mecanismos responsáveis pela síntese deste composto. Os autores obtiveram a produção de 73,3 g/L de etanol, a partir de 92 g/L de glicose e 97 g/L de xilose, na presença de 7,2 g/L de acetato, bem como 10 mM de sorbitol. No entanto, apenas 30 g/L de xilose foram consumidas durante o período de 50 horas. CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica Danielle da Silveira dos Santos 75 2.8.4.5. Adaptação Metabólica Diversos autores reportaram a técnica de adaptação metabólica, Fong et al. (2003), Kuyper et al. (2005), Rosemberg, (2001), Meijnem et al. (2008), dente outros. Segundo Portnoy et al. (2011), o processo de adaptação metabólica promove aclimatação a diferentes condições ambientais, ativação das vias metabólicas, melhorias na utilização de substratos, eleva as concentrações de produto, proporciona maiores valores de produtividade e rendimento em produto, dentre outros benefícios. Nghuyem et al. (1996) realizaram esta técnica adaptativa através de um longo período de cultivo contínuo da bactéria Z. mobilis no hidrolisado ácido de madeira, o que proporcionou redução da sensibilidade celular a componentes inibitórios presentes no meio hidrolisado. Recentemente, Yanase et al. (2007) também reportaram melhorias na espécie Zymobacter palmae após aclimatações sucessivas, reduzindo o tempo de processo de 5 dias a 8 horas, a partir de 40 g/L de glicose e 40 g/L de xilose. Kim et al. (2010) e Agrawal et al. (2011) também sugeriram a utilização da adaptação metabólica sequencial, na qual houve adição de xilose e glicose em diferentes concentrações. Através desta técnica, Agrawal et al. (2011) contornaram o desvio da via das pentoses para xilitol, elevando a produção de etanol pela linhagem ZM4 (ATCC 31821) em até 90 g/L, a partir de 100 g/L da pentose e 100 g/L da hexose, no período de 48 horas. 2.8.4.6. Integração Cromossomal A integração cromossomal de genes responsáveis pela metabolização de xilose é outra questão a ser avaliada, a qual promove maior estabilidade às células (MATSUSHIKA et al., 2009). Desta forma, a construção do transposon pXt contendo os genes XI, XK, TAL, TKL, bem como a integração destes no genoma da bactéria Zymomonas mobilis ZM-mtc9xt foi investigada por Zhou et al. (2011). Os pesquisadores relatam a produção de etanol em 98, 3 g/L e 24,1 g/L a partir de 23% (m/v) de glicose e 6% (m/v) de xilose, respectivamente; misturas de pentose e hexose nas concentrações de 6% (m/v) 17% (m/v), respectivamente, reduziram a produção para 88,9 g/L de etanol. CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica Danielle da Silveira dos Santos 76 2.8.5. TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA PARA DIFERENTES FINALIDADES Além da incorporação de genes que codificam para a atividade de XI, XK, TAL e TKL em Z. mobilis, pesquisas reportam a modificação genética para outras finalidades. São vários os relatos de melhoria da bioconversão da celulose através de microrganismos procariotos geneticamente modificados. Yanase et al. (2005) estudaram a inserção de genes que codificam a enzima β -glucosidase de Ruminococcus albus em Z. mobilis, transferindo-lhe a habilidade de fermentar a celobiose proveniente de materiais lignocelulósicos, atingindo cerca de 10 g/L de etanol. Linger et al. (2010) avaliaram a inserção de genes responsáveis pela síntese de celulases heterólogas, e sugeriram que a bactéria Z. mobilis seria capaz de expressar e excretar altos níveis dessas enzimas, podendo futuramente ser empregada na concepção tecnológica do Bioprocesso Consolidado. Vasan et al. (2011) também realizaram tais estudos, alcançando 0,134 FPU/mL de celulases e 5,79 IU/mL de endoglucanases, no entanto, as mesmas armazenaram-se, em sua maior proporção, no espaço periplasmático das células. Os autores realizaram experimentos utilizando a linhagem recombinante MTCC92, produzindo 12% (m/v), 5,5% (m/v) e 4% (m/v) de etanol, a partir de glicose, CMC e 4% de bagaço de cana pré-tratado, respectivamente. Kaczowka et al. (2005) estudaram sobre a incorporação do gene que codifica para a enzima piruvato descarboxilase proveniente de Z. mobilis, no microrganismo Haloferaz volcanii, pertencente ao grupo Archaea. Tal grupo possui características e propriedades fisiológicas que permitem o crescimento em altas concentrações de sal, temperatura e pH, tornando-o hábil para a produção de etanol sob condições extremas. Kazuyoshi et al. (1991) transformaram o microrganismo Klebsiella oxytoca, inserindo-lhes genes responsáveis pela codificação da enzima piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase da bactéria Zymomonas mobilis, alcançando 40 g/L de etanol e rendimento de 0,48 g produto/ g de CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica Danielle da Silveira dos Santos 77 xilose, assim como de 0,50 g produto/ g glicose. Wood & Ingram (1992) também empregaram a bactéria Klebsiella oxytoca, previamente engenheirada com os genes de Zymomonas mobilis, bem como genes de C. thermocellumm, responsáveis pela síntese de etanol e codificação de endoglucanases (permitindo a degradação de celulose), respectivamente, atingindo 45,2 g/L de etanol e produtividade volumétrica de 1,5 g/L.h a partir de 1% (m/v) de celobiose. 2.9. CONSIDERAÇÕES GERAIS A bactéria Zymomonas mobilis possui características únicas dentre os microrganismos fermentativos, apresentando crescimento, produção de energia e resposta às condições de cultura extremamente peculiares, causando um grande interesse no mundo científico, biotecnológico e industrial. O excêntrico comportamento desta bactéria, que possui habilidade em acoplar e desacoplar a produção de energia a favor da formação do produto, além de possuir comportamentos oscilatórios, permitindo a interação entre a taxa de crescimento celular e a produção de etanol; capacidade de responder a alterações físicas e químicas do meio ambiente, bem como sua diversidade na formação de produtos, torna-a um microrganismo ideal para o estudo e desenvolvimento de processos levados a cabo por agentes microbianos (ELNASHAINE et al., 2006). No entanto, o potencial de utilização industrial de Z. mobilis declinou após a constatação de que o rendimento desta bactéria era inferior ao apresentado pela levedura Saccharomyces cerevisiae quando a fermentação ocorria em melaço e caldo de cana. Na presença de sacarose, a bactéria sintetiza dois subprodutos, a levana e o sorbitol, diminuindo significativamente a produção de etanol. Concluiu-se que a utilização da bactéria Z.mobilis não era vantajosa quando o substrato era a sacarose, embora, visando melhorias na produção de etanol, o uso de invertase para a hidrólise deste substrato vem sendo estudado (LEE & HUANG, 2000). Atualmente, a levedura S. cerevisiae é o microrganismo mais utilizado industrialmente para a produção de etanol, contudo, a questão da escolha de tecnologias mais apropriadas necessite de CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica Danielle da Silveira dos Santos 78 maiores análises, uma vez que há muitas divergências em relação ao microrganismo adequado para a produção de etanol. Quando o substrato é a glicose, Zymomonas mobilis apresenta vantagens competitivas em relação à levedura, pois a bactéria possui elevadas taxas de produção, facilidade de manipulação genética, dentre outras vantagens, tornando relevante o estudo deste microrganismo como uma alternativa promissora na cadeia produtiva do bioetanol. Visando promover também a conversão da xilose proveniente da fração hemicelulósica a etanol, Zhang et al. (1995) iniciaram importantes avanços na engenharia genética de Z. mobilis, uma vez que tal bactéria, naturalmente ocorrente, não possui a habilidade de fermentar esta pentose. Todavia, conforme relatado por diversos autores, o mecanismo gênico desta bactéria não regula corretamente a expressão dos genes inseridos, XI, XK, TAL e TKT. Desta forma, a fermentação deste carboidrato ainda é o foco de diversas pesquisas, pois a habilidade de metabolização da xilose é considerada baixa quando comparada com a da glicose (GAO et al., 2002; JEON et al., 2005). Sumariamente, a estratégia concebida para a elaboração do presente trabalho foi realizar o pré-tratamento químico no bagaço de cana-de-açúcar, sob condições moderadas, seguido do desenvolvimento de diferentes processos de bioconversão, denominados de processo SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) e SSCF (Simultaneous Saccharification and Co-Fermentation). A bactéria Z. mobilis apresenta resultados promissores no que tange à conversão de glicose oriunda da fração celulósica, através do processo SSF, no entanto, poucos estudos reportaram sobre o emprego do bagaço de cana como matéria-prima para a produção de etanol por tal bactéria através dessa tecnologia. O processo de SSCF, considerado um aperfeiçoamento do processo anterior, necessita de um microrganismo capaz de consumir ambos os açúcares presentes neste material lignocelulósico. Neste contexto, com o intuito de conferir ao microrganismo Z. mobilis as características necessárias para fermentar ambos açúcares, a xilose oriunda da fração hemicelulósica e a glicose oriunda da fração celulósica, é necessária a intervenção da engenharia genética e metabólica. CAPÍTULO 3: Justificativas e Objetivos Danielle da Silveira dos Santos 79 _____________________CAPÍTULO 3 JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS 3.1. JUSTIFICATIVAS A cana-de-açúcar é largamente produzida no Brasil e fornece a principal fonte de carboidratos fermentáveis para produção de etanol, embora apenas um terço da biomassa contida no vegetal é, atualmente, empregado para a produção deste biocombustível. A utilização de materiais lignocelulósicos como a palha da cana e o bagaço, um dos principais resíduos agroindustriais gerados em nosso país, desponta como solução para se aumentar o rendimento da produção de álcool em relação à matéria-prima, sem que haja a necessidade de se expandir a área de plantio, favorecendo toda a cadeia produtiva e preservando o meio ambiente. O novo conceito de produção de etanol está associado a sua obtenção a partir da biomassa lignocelulósica, após hidrólise completa das frações polissacarídicas. Neste panorama, faz-se evidente a importância de desenvolvimentos de estratégias para a produção de etanol do bagaço de cana, visto que este resíduo possui alto conteúdo de celulose, que pode ser CAPÍTULO 3: Justificativas e Objetivos Danielle da Silveira dos Santos 80 hidrolisada para a produção de glicose e, posteriormente, possa ser fermentada, através do processo de hidrólise enzimática simultânea à fermentação. O gênero bacteriano Zymomonas possui uma especial habilidade para a produção de etanol, apresentando-se como uma alternativa atraente à atual demanda mundial por petróleo. Quando este microrganismo é comparado com a tradicional levedura, Saccharomyces cerevisiae, verifica-se uma maior taxa especifica de produção de etanol, facilidade de manipulação genética, e menor produção de biomassa. Conforme observado em trabalhos anteriores, a bactéria Zymomonas mobilis mostra-se extremamente atraente para a produção de etanol combustível de segunda geração a partir de glicose proveniente da fração celulósica, em virtude de sua elevada capacidade de absorção de glicose, altas taxas específicas de produção de etanol, resultando em elevados valores de produtividade. No entanto, as linhagens naturalmente ocorrentes mostraram-se incapazes de metabolizar um outro açúcar importante encontrado nas biomassas de composição lignocelulósica, a xilose oriunda da fração hemicelulósica. A experiência aliada à grande competência instalada na produção de bioetanol de segunda e terceira gerações pelos Laboratórios de Desenvolvimento de Bioprocessos da Escola de Química da UFRJ, com colaboração do Laboratório de Biologia Molecular da UnB, especializado em estudos de engenharia genética, criam o ambiente favorável para a realização de experimentos, empregando o microrganismo Z. mobilis, naturalmente ocorrente e recombinante, como agente de processo. Consequentemente, ampliam-se as possibilidades para que, no futuro, o país fabrique em larga escala produtos biotecnológicos de grande interesse industrial. Neste contexto, buscando pelo aproveitamento integral bagaço de cana- de-açúcar, o presente trabalho visa investigar a construção de uma linhagem recombinante de Z. mobilis, através da incorporação de genes responsáveis pela metabolização desta pentose; assim como avaliar o desempenho da linhagem nativa quanto à conversão da glicose oriunda da fração celulósica. CAPÍTULO 3: Justificativas e Objetivos Danielle da Silveira dos Santos 81 Portanto, faz-se evidente a importância do desenvolvimento de um projeto sobre esta temática, envolvendo baixos custos e altas produtividades. A seguir, o objetivo geral e objetivos específicos foram traçados: 3.1. OBJETIVO GERAL Dentro do contexto apresentado acima, o objetivo geral do presente trabalho consiste em investigar a produção de etanol de segunda geração por Zymomonas mobilis CP4 naturalmente ocorrente e recombinante, a partir da fermentação do bagaço de cana-de-açúcar, através da conversão de xilose (hemicelulose) e glicose (celulose), respectivamente. 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Avaliar o desempenho de duas linhagens naturalmente ocorrentes de Zymomonas mobilis, AG11 e CP4, face à utilização de dois açúcares abundantes (glicose e xilose) no bagaço de cana; Otimizar o processo de hidrólise enzimática com preparados comerciais, simultânea à fermentação com a linhagem selecionada a partir de bagaço de cana-de-açúcar (SSF), através de análise de superfície de resposta mediante experimentos multivariados; Avaliar a adição de nutrientes complementares ao hidrolisado celulósico do bagaço de cana para a produção de etanol por Z. mobilis através de planejamento experimental; Reproduzir os resultados obtidos no planejamento experimental em biorreator instrumentado, com as variáveis significativamente mais favoráveis à produção de etanol a partir de bagaço de cana-de-açúcar (SSF) segundo os experimentos conduzidos em frascos agitados; Otimizar o processo de hidrólise enzimática com preparados comerciais simultânea à fermentação com a linhagem selecionada a partir de resíduos da indústria de celulose através de análise de superfície de resposta mediante experimentos multivariados; Avaliar a adição de nutrientes complementares ao hidrolisado celulósico CAPÍTULO 3: Justificativas e Objetivos Danielle da Silveira dos Santos 82 de resíduos da indústria de celulose para a produção de etanol por Z. mobilis através de planejamento experimental; Reproduzir os resultados obtidos no planejamento experimental em biorreator instrumentado, com as variáveis significativamente mais favoráveis à produção de etanol a partir de resíduos da indústria de celulose, segundo os experimentos conduzidos em frascos agitados; Construir uma linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4 com habilidade de fermentar pentoses (C5), através da incorporação de genes que codificam a atividade de xilose isomerase, xiluloquinase, transquetolase e transaldolase; Selecionar clones que apresentassem maior produção de etanol, bem como crescimento de biomassa celular a partir de glicose e xilose; Estudar uma estratégia de adaptação metabólica para propagação celular em meio sintético contendo diferentes concentrações de glicose e xilose; Estudar uma estratégia para propagação celular em meio contendo hidrolisado com alto teor de xilose (aclimatação celular); Investigar a viabilidade da realização de um processo simultâneo de hidrólise enzimática de celulose e co-fermentação (SSCF), abordando o desempenho da linhagem face à utilização de diferentes concentrações de celulignina e de hidrolisado ácido provenientes do bagaço de cana, através de análise de superfície de resposta mediante experimentos multivariados; Reproduzir os resultados obtidos no planejamento experimental em biorreator instrumentado, com as variáveis significativamente mais favoráveis à produção de etanol a partir de bagaço de cana-de-açúcar, bem como do hidrolisado hemicelósico (SSCF), segundo os experimentos conduzidos em frascos agitados. CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos Danielle da Silveira dos Santos 83 _____________________CAPÍTULO 4 MATERIAIS E MÉTODOS Neste capítulo são apresentados os materiais e as metodologias utilizadas para a execução do presente trabalho. Foram estabelecidos: crescimento e manipulação do microrganismo naturalmente ocorrente e recombinante. A metodologia experimental utilizada para obtenção de etanol foi desenvolvida, inicialmente, através de frascos agitados com posterior reprodução das condições ótimas em biorreator instrumentado, através das tecnologias SSF e SSCF. Para a otimização do processo foram empregados planejamentos experimentais, através de análise de superfície de resposta mediante experimentos multivariados. CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos Danielle da Silveira dos Santos 84 4.1. MATÉRIA-PRIMA 4.1.1. BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR O bagaço de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), utilizado no presente trabalho, foi gentilmente cedido pela Destilaria Costa Pinto (SP-Brasil). Esta biomassa de composição lignocelulósica foi inicialmente secada a 60 o C em estufa ventilada por 12 horas. Em seguida, a mesma foi cominuída e acondicionada em sistemas herméticos para posterior uso. 4.1.2. RESÍDUO DA INDÚSTRIA DE CELULOSE O resíduo de papel, utilizado no presente trabalho, consiste na polpa coletada após a deslignificação na indústria de celulose. Nesta etapa do processamento, a polpa proveniente do cozimento é submetida a uma deslignificação com oxigênio a fim de remover o conteúdo de lignina da polpa que alimenta a planta de branqueamento e enviar a lignina dissolvida de volta ao sistema de recuperação. A biomassa residual da indústria de celulose foi gentilmente cedida pela empresa ARACRUZ Celulose e codificada como PM2, a qual contém 79,4% de celulose, 15,1% de hemicelulose e 1,8% de lignina (SILVA, 2009). Dessa forma, diferentemente do bagaço, não foram necessárias execuções de pré- tratamentos químicos, apenas lavagens em água destilada e ajuste do pH para 5 (adição de H 2 SO 4, 1M; ou NaOH, 1M, se necessário). 4.2. PRÉ-TRATAMENTOS DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR 4.2.1. PRÉ-TRATAMENTO ÁCIDO O pré-tratamento ácido foi realizado para desorganizar a matriz lignocelulósica e remover a fração hemicelulósica. As condições para a realização do pré-tratamento ácido foram as preconizada por Betancur (2010) e detalhadas a seguir: concentração de H 2 SO 4, 1,09% (v/v) ; relação sólido-líquido 1:2.8 (g/ml); temperatura de 121 o C e tempo de exposição de 27 minutos em autoclave. A hemicelulose (fase aquosa) foi retirada utilizando uma prensa hidráulica, através de um procedimento de filtração simples do meio pré-tratado; CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos Danielle da Silveira dos Santos 85 sendo a fase sólida denominada de celulignina, em função da sua composição majoritária em celulose e lignina. As etapas descritas para a obtenção do hidrolisado hemicelulósico podem ser visualizadas na figura 4.1. Figura 4.1. Etapas do pré-tratamento ácido: bagaço in natura (a), peneiração do bagaço (b), exposição do bagaço ao ácido (c), distribuição em frascos (d), tratamento térmico em autoclave (e), distribuição em prensa hidráulica (f), prensagem para separação do bagaço acidificado (celulignina) (g). A figura 4.2 ilustra o bagaço de cana-de-açúcar in natura e após remoção da fração hemicelulósica. A lignina manteve-se mais concentrada após a etapa de pré-tratamento ácido, fazendo com que a coloração do sólido residual passasse a ser mais escura, quando comparada ao bagaço in natura (Figura 4.2. A). Figura 4.2. Bagaço de cana-de-açúcar in natura (A); Bagaço de cana-de-açúcar após pré- tratamento ácido (Celulignina) (B). O hidrolisado, licor resultante deste processo (hemicelulose), teve seu pH corrigido para 5 mediante a adição de Ca(OH) 2 sob banho de água e gelo, para evitar o aquecimento gerado em excesso durante este procedimento. Em A B C D E F G CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos Danielle da Silveira dos Santos 86 seguida, a solução contendo cerca de 80 g/L de xilose, foi filtrada a vácuo, buscando retirar o precipitado formado, resultando no material desejado para ser utilizado como base do meio de fermentação (FOGEL, 2005). 4.2.2. PRÉ-TRATAMENTO ALCALINO Este pré-tratamento alcalino se faz necessário para aumentar a acessibilidade das enzimas às fibras celulósicas (BARCELOS et al., 2012). Dessa forma, a celulignina foi submetida à deslignificação com uso de solução de NaOH a 4% (m/v), na relação sólido-líquido de 1:20 (VÁSQUEZ, 2007) e submetida a tratamento térmico (121 o C por 30 minutos) em autoclave (Figura 4.3). Figura 4.3. Etapas do tratamento alcalino: celulignina de bagaço de cana após pesagem (a), tratamento alcalino com NaOH diluído (b), separação em prensa hidráulica após tratamento em autoclave (c), celulignina obtida/licor alcalino (d ). Posteriormente, sequências de lavagens com água destilada foram feitas, no que tange à remoção da alcalinidade intersticial na matriz sólida e extração da lignina residual, até que a água descartada fosse clara, constatando-se a máxima remoção da lignina nas condições impostas (Figura 4.4). Figura 4.4. Fração líquida após pré-tratamento alcalino do bagaço de cana (A), sequência de lavagens com água destilada para a remoção da lignina residual (B- E). A B C D CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos Danielle da Silveira dos Santos 87 4.2.3. PRÉ-HIDRÓLISE ENZIMÁTICA Após os pré-tratamentos químicos com ácido e base diluídos, foi realizada a etapa de pré-hidrólise enzimática, na qual a celulose pôde ser convertida a açúcares fermentáveis. Dessa forma, a celulignina pré-tratada alcalinamente e lavada com água destilada foi submetida à hidrólise enzimática com uso de um preparado celulásico comercial (Multifect, Genencor, USA), que continha atividade FPásica de 100 FPU/mL. A atividade enzimática foi determinada em papel de filtro, como recomendado por Ghose (1987) e expressa como FPU (Filter Paper Units) por mililitro da mistura. O experimento foi desenvolvido utilizando-se diferentes valores de cargas enzimáticas, que estão apresentados nas tabelas 4.4 e 4.5, do item 4.3.3.2. A temperatura foi mantida em 50 o C, durante 12 horas para o bagaço de cana e para o resíduo da indústria de celulose. Na figura 4.5, observa-se um cromatograma típico da pré-hidrólise enzimática, no qual se percebe a alta concentração de glicose (tempo de retenção de 11,07 min), resultante da ação das enzimas do complexo celulásico. Em menor proporção, observa-se, ainda, a presença de celobiose (tempo de retenção de 9,536 min) e de outras substâncias que não foram identificadas, mas que, provavelmente, referem-se à presença de celo-oligosacarídeos. Figura 4.5. Perfil cromatográfico típico do hidrolisado celulósico pré-tratado enzimaticamente. 4.3. A BACTÉRIA Zymomonas mobilis NATIVA Neste trabalho foram empregadas duas linhagens nativas de Zymomonas mobilis, AG11 e CP4, as quais foram gentilmente cedidas pelo Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco. Posteriormente, no item 8 ,1 6 7 8 ,1 9 7 9 ,2 4 7 c e lu b io s e - 9 ,5 3 6 1 0 ,3 2 8 g lic o s e - 1 1 ,6 7 6 1 2 ,6 6 9 3 7 ,0 0 8 mV 20,00 40,00 60,00 80,00 Minutes 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00 36,00 38,00 40,00 CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos Danielle da Silveira dos Santos 88 4.4, foram empregadas técnicas de biologia molecular no que tange à transformação da linhagem CP4, seguidas de ensaios de fermentação. Após o crescimento bacteriano nos meios de cultura foram retiradas amostras assepticamente com auxílio de uma alça de platina e, então, foram preparados esfregaços em lâminas para posterior coloração, segundo o método Gram. As lâminas com material microbiano foram analisadas em microscópio binocular com aumento de 1000x. Na figura 4.6 (A e B) observa-se a diferença entre as duas linhagens nativas, ressaltando o caráter floculante da linhagem CP4 (Fig. 4.6 A e Fig. 4.7). Figura 4.6. Microscopia das linhagens de Z. mobilis (aumento de 1000x). As lâminas foram coradas pelo método Gram, mostrando que a bactéria apresenta- se como gram negativa. (A) Linhagem CP4 e (B) Linhagem AG11. Figura 4.7. Linhagem floculante de Zymomonas mobilis CP4 crescida por 24 horas em meio de cultura. 4.3.1. MANUTENÇÃO DAS CULTURAS DE Z. mobilis As culturas foram preservadas a 4°C, após crescimento em tubos tipo Falcon, incubados em estufa a 30°C por 24 horas em meio líquido, contendo glicose (20 g/L) e extrato de levedura (5 g/L) (SWING & DE LEY, 1977). As linhagens de Z. mobilis foram repicadas mensalmente. CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos Danielle da Silveira dos Santos 89 O microrganismo também foi mantido em ágar inclinado e em placa de petri, empregando o meio Swing & De Ley (SDL), e armazenado a 4ºC, após ser incubado em estufa com temperatura controlada de 30 o C durante aproximadamente 48h (SWING & DE LEY, 1977). A composição do meio agarizado está descrita na tabela 4.1. Com a finalidade de manter as células ativas para a realização dos diferentes experimentos, repiques periódicos a partir do cultivo original foram realizados a cada três meses em câmara asséptica. Tabela 4.1. Meio de manutenção de Z. mobilis. Nutrientes Concentração (g/L) Glicose 20 Extrato de levedura 2,5 Agar 20 4.3.2. PRÉ- INÓCULO E INÓCULO: COMPOSIÇÃO DE MEIO E CONDIÇÕES DE CULTIVO A tabela 4.2 apresenta a composição do meio de cultivo, adaptado de Neto et al. (2005), o qual foi utilizado no preparo do pré-inóculo e do inóculo para os ensaios de fermentação com as linhagens nativas. Tabela 4.2. Meio de crescimento de Z. mobilis. Nutrientes Concentração (g/L) Glicose 20 Extrato de levedura 2,5 (NH 4 )SO 4 1 KH 2 PO 4 0,5 MgSO 4 . 7H 2 0 0,5 Os meios de cultura foram autoclavados por 15 min., sob pressão de 0.5 kgf/cm 2 e temperatura de 120ºC. A solução de glicose foi esterilizada separadamente dos outros componentes, de modo que esta representasse 50% do volume total e a solução de glicose os 50% restantes. Cabe ressaltar que toda vidraria utilizada nos experimentos também foi esterilizada em autoclave durante 20 minutos, sob pressão de 1 kgf/cm 2 e temperatura de 120ºC, seguida de secagem em estufa de esterilização Mod. FIC. 05. FAMO (50 a 60 ºC). CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos Danielle da Silveira dos Santos 90 O pré-inóculo foi preparado em tubos tipo Falcon de 50 mL com 20 mL de volume de meio de crescimento, acrescentado de 2 mL de meio líquido de manutenção cultivado com a bactéria. Os meios foram incubados a 30 o C por 20 horas, sem agitação. No preparo do inóculo foram utilizados frascos cônicos de 500 mL. O volume de trabalho foi de 200 mL de meio de crescimento, adicionado do volume total de cada tubo Falcon (20 mL) do pré-inóculo. O inóculo foi incubado na temperatura de 30 o C, por 20 horas, sem agitação. Ao final da etapa de propagação, procedeu-se à quantificação de células e posterior cálculo do volume a ser centrifugado, visando obter as concentrações celulares pretendidas para se inocular nos posteriores experimentos de fermentação (item 4.4.3.2). 4.4.3. ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO A tabela 4.3 apresenta um esquema geral, visando facilitar a compreensão das etapas definidas para frascos agitados no que tange à produção de etanol por Z. mobilis AG11 e CP4 nativas. Inicialmente, foram desenvolvidos experimentos preliminares, nas etapas 1 e 2; nas etapas 3 e 4 foram avaliadas diferentes condições do processo SSF a partir de bagaço de cana e resíduos da indústria de celulose como substrato para a produção de etanol, através de planejamentos de superfície de resposta. Tabela 4.3. Experimentos sequenciais avaliando a bactéria Zymomonas mobilis naturalmente ocorrente frente à produção de etanol. Experimentos preliminares 1 Desempenho das linhagens AG11 e CP4 nativas utilizando glicose e xilose Otimização através de Planejamentos de Superfície de resposta 2 Otimização do SSF através de análise de superfície de resposta 3 Avaliação da adição de nutrientes complementares ao hidrolisado celulósico Onde: meio sintético (1), bagaço de cana e resíduo da indústria de celulose (2-3); S:L= sólido: líquido. CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos Danielle da Silveira dos Santos 91 4.4.3.1. Desempenho das linhagens nativas frente à utilização de glicose e xilose Inicialmente, para se verificar/avaliar a capacidade de utilização de glicose e xilose, foram realizados experimentos em meios quimicamente definidos com as linhagens nativas de Z. mobilis AG11 e CP4, analisando-se o consumo de substrato, produção de etanol e crescimento celular, bem como as variáveis de resposta dos cultivos (produtividade volumétrica em etanol e taxa específica de crescimento). Esses experimentos foram realizados em frascos cônicos de 500 mL com 200 mL de meio contendo glicose e xilose, separadamente, nas concentrações de 20 g/L, sendo as concentrações dos outros nutrientes e as condições operacionais as mesmas daquelas utilizadas no preparo do inóculo, descritas anteriormente (item 4.3.2). Este ensaio foi de fundamental importância, pois em função dos resultados se poderia inferir em relação à estratégia mais adequada para a produção de etanol com as linhagens bacterianas. Isto é, caso se constatasse a capacidade das linhagens nativas em consumir ambos os açúcares, o aproveitamento da fração hemicelulósica (rica em xilose) seria incorporado em nosso planejamento experimental; no caso de não haver metabolização desse açúcar, a transformação genética seria recomendada para posteriores ensaios envolvendo misturas de xilose e glicose pela linhagem recombinante (item 4.4.2). 4.4.3.2. Produção de etanol a partir do bagaço de cana e resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis nativa através do processo SSF A fração sólida residual dos pré-tratamentos do bagaço de cana, assim como os resíduos da indústria de celulose (PM2) possuem um alto conteúdo de celulose, que pode ser utilizada para a obtenção de etanol por fermentação mediante técnicas que possibilitem o aproveitamento de glicose contida nos resíduos. Entre as técnicas que poderiam ser avaliadas encontram-se a hidrólise enzimática e a aplicação do processo SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation). CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos Danielle da Silveira dos Santos 92 Após 12 horas de pré-hidrólise enzimática do bagaço de cana de PM2 ( VÁSQUEZ, 2007 ), a cinética do processo SSF foi avaliada em frascos cônicos de 500 mL contendo 200 mL de meio de fermentação, que apresentava a mesma composição do meio de propagação, com exceção da adição de glicose, que foi substituída pelo pré-hidrolisado da celulose, rico neste açúcar. A fermentação ocorreu por aproximadamente 48 horas, com diferentes concentrações de inóculo (relatado a seguir), na temperatura de 30 o C, velocidade de agitação de 150 rpm, com amostragens de 2 mL a cada 3 horas . O consumo de substrato e a formação de produto foram acompanhados durante o tempo necessário, para verificar o esgotamento da fonte de carbono. Sumariamente, os experimentos de hidrólise e sacarificação simultâneas foram desenvolvidos através da construção de três planejamentos experimentais empregando-se o bagaço de cana. No primeiro ensaio visou-se as condições ótimas do processo SSF e no segundo avaliou-se a adição de diferentes nutrientes no meio hidrolisado celulósico do bagaço. Foram desenvolvidos dois planejamentos experimentais empregando-se o PM2, referentes à determinação das condições ótimas do SSF, assim como a avaliação da adição de diferentes nutrientes no meio hidrolisado celulósico. III. Otimização da produção de etanol a partir de bagaço de cana e PM2 por Z. mobilis CP4 nativa No presente trabalho, os planejamentos experimentais que aplicaram os princípios da metodologia estatística de superfície de resposta objetivaram avaliar os efeitos agregados de variáveis com a finalidade de determinar as condições ótimas para sistemas com multivariáveis (BOX, 1978). Nesta etapa, além dos níveis inferiores e superiores apresentados na matriz usada no Planejamento anterior, foram feitos o acréscimo dos pontos axiais para obtenção da curvatura de máximo absoluto. Desta forma, foi construído um planejamento experimental completo 2 3 , com 6 pontos axiais e 6 repetições do ponto central, totalizando 20 experimentos. Os parâmetros analisados foram a relação sólido:líquido (celulignina pré-tratada alcalinamente:meio), carga enzimática e concentração celular, conforme a matriz apresentada nas tabelas 4.4 e 4.5. As variáveis de CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos Danielle da Silveira dos Santos 93 respostas escolhidas foram: glicose inicial do SSF, concentração final de etanol e produtividade volumétrica. Tabela 4.4. Variáveis independentes do planejamento experimental central composto: relação sólido:líquido (g:mL), carga enzimática (FPU/g) e concentração celular (g/L), avaliando a produção de etanol, produtividade volumétrica, bem como a glicose inicial do processo SSF utilizando o bagaço de cana. Tabela 4.5. Variáveis independentes do planejamento experimental central composto: relação sólido:líquido (g:mL), carga enzimática (FPU/g) e concentração celular (%), avaliando a produção de etanol a partir do processo SSF utilizando o resíduo da indústria de celulose. Uma vez que ensaios prévios utilizando as mesmas concentrações de células empregadas no planejamento utilizando o bagaço de cana não resultaram em bom desempenho do microrganismo frente à utilização do resíduo da indústria de celulose; posteriormente, ao estruturarmos o planejamento referente ao resíduo da indústria de celulose, as células não foram adicionadas no processo através de centrifugação. IV. Análise da adição de diferentes componentes do meio no hidrolisado celulósico do bagaço de cana e PM2 frente à produção de etanol a Yüklə 5,04 Kb. Dostları ilə paylaş:
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