15-rasm. Ti-plazmidadan vektor sifatida foydalanish. Dastlab Ti-plazmidadan restriktazalar yordamida T-DNK kesib
olinadi. Kesib olingan T-DNK
E. coli bakteriyasining
pBR322 plazmidasiga kiritiladi. pBR322 plazmidasidagi T-DNKga
o'simlik geni joylashtiriladi. Gibrid plazmida hosil bo'ladi. Bu plazmida agrobakteriyaga qayta kiritiladi. Agrobakteriya
esa o'simlikka yuboriladi.
Dastlab Ti-plazmidaning T-segmenti restriktazalar bilan kesiladi. T-segmentni
ko'paytirish uchun
Escherichia coli bakteriyasinng
pBR322 plazmidasiga kiritiladi.
pBR322 replikatsiyalanganda undagi T-segmentni soni ham ko'payadi.
Bu jarayon
klonlash
deyiladi. Tarkibida T-segment saqlagan pBR322 plazmidasi etarlicha
klonlangandan keyin bakteriyadan ajratiladi. Ajratilgan gibrid plazmidaga o'simlik
geni joylashtiriladi va yana klonlash uchun
Escherichia coli
bakteriyasiga qayta
kiritiladi. Klonlangan plazmidalar
Escherichia coli
bakteriyasidan
ajratiladi va
agrobakteriya sitoplazmasiga kiritiladi. So'ngra agrobakteriya o'simlikka yuboriladi.
Agrobakteriyadagi gibrid plazmidaning T-segmenti o'simlik genomiga qo'shilib
ketadi. Transgen o'simlik ana shunday tehnologiya asosida yaratiladi.
Yuqorida keltirilgan tehnologiyani biroz soddalashtirish mumkin. Buning
uchun binar vektor sistemalardan foydalaniladi. Bunda agrobakteriya hujayrasida
ikki hil modifikatsiyalangan Ti-plazmida bo'lishi kerak. Plazmidalarning biridafaqat
vir-zona bo'ladi. vir-zona T-DNK kesilishi uchun javobgar. Bunday plazmidalar
yordamchi plazmidalar deyiladi.
Ikkinchi plazmidada esa faqat o'simlik geni kiritilgan T-DNK bo'ladi.
Ikkala plazmida bitta hujayraga joylashtiriladi. Agrobakteriya ikki hil
plazmidasi bilan birga o'simlikka yuboriladi. Yordamchi plazmidaning vir-zonasi
ikkinchi plazmidaning T-segmentini kesadi. Yuqorida ta'kidlanganidek, T-segment
o'simlik genomiga birikadi.
Qisqa qilib aytganda, Ti-plazmida asosidagi ideal vektor sistema quyidagi
elementlar va hossalarga ega bo'lishi zarur:
1)
o'simlik genomiga barqaror qo'shilishi uchun barcha kerakli signallar,
genlarning ekpressiya sistemasi (o'simlik polimerazalari «taniydigan» promotor),
transformatsiyalangan hujayralarni selektsiyasi (saralash) uchun marker;
2)
vektor sistemada onkogenlar bo'lmasligi kerak. Ular o'simlik hujayralarini
differentsiyallanishini to'htadi.
Onkogenlarni yo'qotish uchun
transpozonli mutagenez
(transpozon - ko'chib
yuruvchi genetik element) usuli qo'llaniladi. T-DNKga transpozonlar kiritilsa,
o'simlikda
shish hosil qiladigan genlar (
iaaM, iaaH, ipt
) «o'chiriladi». Transpozonlar
T-DNKni o'simlikka o'tishiga halaqit qilmaydi. Transpozonli mutagenezda Tn5, Tn7
bakterial transpozonlardan foydalaniladi.
Ti-plazmidani modifikatsiyalashda restriktsiya saytlariga (restriktazalar kesadigan
uchastkalar) ham e'tibor berish kerak. Modifikatsiyada EcoR1,
Hind III, BamH1 va
boshqa restriktazalar ishlatiladi. Ba'zida ma'lum bir saytning 18-20uchastkasidan
taniydigan turli hil restriktazalar bo'ladi. Shuning uchun bunday uchastkalar
polilinkerlar
deb ataladi.
Bundan tashqari, vektor molekulalarini konstruktsiyalashda promotorlarga ham
e'tibor berish kerak. Promotor quyidagi hossalarga ega bo'lishi kerak:
faol ekspressiya;
to'qima va organspetsifik ekspressiya;
boshqarilish imkoniyati.
Ayrim genlar yuqori temperatura ta'sirida faollanadi.
Bunday genlar
boshqariladigan promotorlarga misol bo'ladi. Ayrim genlar zahira oqsillari (masalan,
boshoqli o'simliklarda uchraydigan zein oqsili) sintezini nazorat qiladi. Ular to'qima
spetsifik ekspressiyaga misol bo'ladi.
O'simliklar gen muhandisligida ko'p ishlatiladigan promotor - CAMV
(
cauliflower mosaic virus
– gulkaram mozaikasi virusi) promotori. CAMV
promotoriga ulangan genlar o'simlikning barcha to'qimalarida faol ekpressiyalanadi.
Va nihoyat vektorlarda markerlar ham bo'lishi zarur. Chunki transgen o'simliklar
marker genlar yordamida saralanadi. Marker genlar reporter genlar ham deyiladi.
Marker genlar soni anchagina. Misol uchun,
luxA va luxB genlari. Ular tunda yonib
turadigan hasharotlar DNKsidan ajratilgan. luxA va luxB genlari lyutsiferaza
fermenti sintezini boshqaradi. Lyutsiferaza oksidlangan lyutsefirin pigmentini
lyutsefiringa o'tish reaktsiyasini katalizlaydi. Tungi hasharotlarning yonib turishiga
luytsefirin pigmenti sababchidir. luxA va luxB marker genlarini saqlagan transgen
o'simlikni boshqalaridan ajratib olish oson. Chunki ular, yuqorda aytganimizdek,
chiroq shu'lasi kabi yonib turadi.
Ohirgi paytlarda pgfp markeri ham keng ishlatilmoqda. Bu gen
GFP-oqsili (green
fluorescent protein) sintezini nazorat qiladi.
U Acquorea victoriameduzasining
DNKsidan olingan. Tanasida pgfp markeri saqlagan transgen o'simlikka
ul'trabinafsha nur tushurilsa, u yashil rang berib tovlanadi.
T-DNK orqali o'simlik hujayralarini transformatsiyalashning an'anaviy usuli -
mahsus jarohatlangan yosh o'simlik novdasiga tarkibida
Ti-plazmida mavjud
agrobakteriyani
kiritish. Hozirda transgen o'simlik olishning bir necha hil usullari
ishlab chiqilgan. Hattoki mahsus
«Shotgun» qurilmasi yaratilgan. DNK molekulalari
vol'fram sharchalar bilan o'raladi va «Shotgun» qurilmasida o'simlik tanasiga
miltiqdan o'q otish kabi otiladi.
Dostları ilə paylaş: