Pzr uchun ishchi aralashma (master mix ) tayyorlash va termotsikler (pzr) bilan ishlashni o'rganish. Reaksiya qo'yish

Molekulyar markerlar va ularning genlarni kartalashtirishdagi ahamiyati.

Molekulyar markerlar o’zi nima, ularning vazifazi nimalardan iborat? Molekulyar markerlar (yoki DNK markerlari) – irsiyatning standart qonunlari asosida bir avloddan keyingi avlodga ko’chib o’tadigan, genomning spetsifik regionlarini belgilovchi aniq DNK ketma-ketliklari demakdir. Ularning mavjudligi zamonaviy DNK texnologiyalari asosida aniqlanadi va bu biron bir belgi bilan assotsiatsiyalangan (bog’langan) genlar mavjudligidan dalolat beradi. DNK markerlari o’zining yuqori informativligi, spetsifikligi, polimorfikligi va foydalanish qulayligi sababli molekulyar-genetik tadqiqotlarda mustahkam o’rin egallab kelmoqda. Quyida ularning ba’zilari haqida misollar keltirilgan.
RFLP – Restricted Fragment Length Polymorphism (Bo’laklangan Fragmentlar Uzunliklari Polimorfizmi - BFUP). RFLP tahlili ilk bor Jeffris tomonidan 1985 yil olib borilgan (Jeffreys et al., 1985).
Bu usulda restriktazalar DNKni maxsus uchastkalarda, odatda palindrom ketma-ketliklarda parchalaydi. Mutatsiya natijasida shunday ketma-ketliklarning asoslaridan biri o’zgarib qolgan bo’lsa bu uchastkalar restriktazalar yordamida parchalanmaydi. Aksincha mutatsiya natijasida restriktazalarga chidamli bo’lgan boshqa yangi uchastkalar paydo bo’lishi mumkin. Xolbuki gipervariabel uchastkalar genomning transpozitsiya, noteng rekombinatsiyalar va DNK-polimeraza kompleksining "sirg’alishi" kabi anchayin murakkab tarkib topishidan kelib chiqqan. Natijada esa ikki genetik noo’xshash individrardan kelib chiqqan bir-biriga mos keluvchi DNK fragmentlari tez-tez har xil uzunlikda restriktsion fragmentlarni yuzaga keltiradi. Bu marker tizimining bir qancha kamchiliklari mavjud, jumladan yuqori mehnat, qimmatliligi shuningdek irsiylanishning dominant ko’rinishi (geterozigota genotipini aniqlash imkoniyati yo’q).
RAPD markerlari (Random Amplified Polymorphic DNA - Tasodifiy Amplifikatsiyalangan DNKlar Polimorfizmi) PZRga (Polimeraza Zanjir Reaktsiyasi) asoslangan bo’lib, usulning asosiy mohiyati DNK regionlarining qisqa (10 nukleotidgacha) erkin oligonukleotidlar tomonidan tasodifiy amlifikatsiyalanishi bilan belgilanadi. Praymerlarning kerakli uchastkalarga borib (gibridizatsiya) juda yumshoq sharoitda amalga oshiriladi. RAPD praymerlari DNKning o’ziga komplementar bo’lgan uchastkasi bilan bog’lanadi va amplifikatsiya ikkala zanjirda ikki yo’nalish bo’ylab amalga oshadi. Praymerlanish o’rtacha holda har bir million juft asosga bir marta to’g’ri keladi (Jones et al. 1997). Bitta praymer tegishli tur yoki individuum DNK o’xshash uchaskasiga bog’liq holda bir necha PZR mahsulotlari berishi mumkin. RAPD markerlai odatda populyatsiyaning genetik strukturasini o’rganishda yoki genetik kartalashtirishda foydalanilishi mumkin.
RAPD-markerlari boshqa tip markerlariga nisbatan ancha arzon, sodda va qulayligi bilan ajralib turadi. Bu usulda radioaktiv moddalar ishlatilmaydi, probalarni tayyorlash uchun maxsus tayorgarlik talab qilinmaydi va hattoka DNK ketma-ketligini ham oldindan bilish shart emas. Biroq bu markerlardagi kamchilik ularning dominatligida va bu geterozigota ni gomozigotadan farqlashda va buning natijasida esa allellar chastotasini aniqlashda ancha qiyinchiliklar keltirib chiqaradi.
AFLP – Amplified Fragment Length Polymorphism (Amplifikatsiyalangan Fragment Uzunligi Polimorfizmi). Bu usul amprifikatsiya va restriktsiya etaplaridan tashkil topgan bo’lib eng avvalo genom DNKsi restriktazalar nabori (odatda, ikki 4 va 6 nukleotidlar ketma-ketligini taniydigan restriktazalar juftligi) bilan ishlanadi. Hosil bo’lgan fragmentlarga adapterlar ulanadi. So’ngra adapter praymerlari yordamida amplifikatsiyalanadi va undan keyin esa 3’ uchida restriktsiya sayiga tegishli bo’lgan uch erkin nukleotid tutuvchi adapter ketma-ketligiga mos praymerlar yordamida selektiv amplifikatsiya o’tkaziladi. Tripletlar amplifikatsiyani restriktsion fragmentlarning ba’zi qismlari bilan ta’minlaydi. Bu usul yordamida nukleotid ketma-ketligini bilmasdan turib ham katta miqdordagi SNPlarni tahlil qilish mumkin (Vos et al. 1995). AFLP markerlarini qo’llab Genetika va O’EB institututida (Abdurakhmonov et al., 2004) bir necha o’zbek navlarining molekulyar-genetik pasporti yaratilgan. Mikrosatellitlar yoki SSR (SSR – Simple Sequence Repeat - Oddiy takrorlanuvchi ketma-ketliklar). SSR markerlari o’zining yuqori polimorfliligi hamda bilan boshqa markerlardan ajralib turadi. Mikrosatellitlar hattoki yaqin qarindosh bo’lgan individuumlar lokusarida ham yuqori polimorfizm namoyon etadi. (Tautz 1989). Mikrosatellit ketma-ketliklari odatda dinukleotid (AC)n, (AG)n, (AT)n; trinukleotid (CGG)n, (GCC)n, (TCT)n, (TTG)n; tetranukleotid (TATG)n va h-o bo’lib, “n” – mikrosatellit lokuslar ichidagi ketma-ketlikliklari takrorlarining miqdorini bildiradi. O’simliklarda eng ko’p uchraydigan mikrosatellit takrorlar (AT)n, hayvonlarda esa (AC)n ekanligi olimlar tomonidan qayd etilgan (Morgante et al., 2002; Panaud et al., 1995) i (GT)n (Rafalski et al. 1994). Mikrosatellitlar genlar ekspressiyasi regulyatsiyasida, rekombintsiyasida, gen konversiyasida va jinsning aniqlanishida ishtirok etishi taxmin qilinadi.
Ba’zi olimlarning ta’kidlashicha mikrosatellitlarning yuqori stabilligi sabab ularni genetik markerlashda, populyatsion tadqiqotlarda va hattoki genom daktiloskopiyasi usulidan foydalanib shaxsning identifikatsiyasida ishlatilishi mumkin (Ivanov, 1989; Edwards et al., 1991; Decorte , Cassiman, 1993). Mikrosatellit markerlardan foydalanib tadqiqotchi va olimlar tomonidan bir qancha ilmiy tadqiqotlar olib borilgan. Xususan genomni kartalashtirish, o’simliklarda qimmatli xo’jalik belgilarga javob beruvchi QTL lokuslarini aniqlash, turlarning bir-birlari bilan filogenetik qardoshligini aniqlash kabi ishlar bunga misol bo’la oladi. Mamlaktimiz olimlari tomonidan ham ushbu markerlar tizimidan foydalanib bir qancha halqaro darajadagi tadqiqotlar amalga oshirilgan. Jumladan g’o’zaning tabiiy holdagi barg to’kishi, tola chiqimi, sifat ko’rsatkichlari, fotoperiodik gullash kabi belgilari SSR markerlari tomonidan tadqiq qilingan (Abduraxmonov va boshq, 2005; 2007; 2008).
CAPs - (Cleaved Amplified Polymorphism - Parchalangan Amplikonlar Polimorfizmi) va dCAP (ishlab chiqilgan CAP).