АМЕА-nın Xəbərləri (biologiya və tibb elmləri), cild 71, №1, səh. 11-19 (2016)
11
E
b
Genoma Malik Thinopyrum bessarabicum Yabanı Buğda Otu Növünün
Xromosomlarının İdentifikasiyası Üçün Spesifik RAPD Markerlərin
Müəyyənləşdirilməsi
Ə.Ç. Məmmədov
AMEA Molekulyar Biologiya və Biotexnologiyalar İnstitutu, Mətbuat prostekti, 2a, Bakı AZ1073,
Azərbaycan; E-mail: amamedov_ib@yahoo.co.uk
Yabanı buğda otu Thinopyrum bessarabicum (J = J
b
= E
b
) Á. Löve Triticum buğda cinsinə yaxın olan çox
əhəmiyyətli cinsdir. Thinopyrum bessarabicum Qara və Aralıq dənizləri ərazisində 350 mM NaCl duzu
qatılığında özünün həyat tsiklini tamamlamaq qabiliyyəti olan təbii alaq otudur. Tədqiqatlar nəticəsində
Thinopyrum bessarabicum-un E
b
genomunun 1E
b
, 2E
b
, 5E
b
, 4E
b
və 7E
b
xromosomların hər birinin identi-
fikasiyası üçün spesifik RAPD markerlər müəyyən edilmişdir amma, 3E
b
və 6E
b
xromosomlar üçün spe-
sifik RAPD praymerlər işlənib hazırlanmayıb. Aparılan tədqiqat işinin məqsədi Thinopyrum bessarabi-
cum-un E
b
genomunun 3E
b
və
6E
b
xromosomlarının identifikasiyası üçün spesifik RAPD markerlərin
müəyyən edilməsidir.
Açar sözlər: Thinopyrum bessarabicum, E
b
genom, xromosomlar, RAPD marker, hibridlər, disomik əlavə
olunmuş xətlər, PZR
GİRİŞ
Yabanı Thinopyrum bessarabicum (Savul &
Rayss) Á. Löve (J = J
b
= E
b
) buğda otu yem və mə-
dəni dənli bitkilər üçün mühüm genlərin mənbəyi
və ehtiyatıdır. Onların xromosom təşkili haqqında
biliklər rüşeym plazmaların yaxşılaşdırılması proq-
ramlarında bu mühüm genofondun istifadəsi üçün
həlledici əhəmiyyətə malikdir. Triticeae ailəsinin
genom səviyyəsində təsnifatlaşdırılması bu cinsə
yalnız Th. bessarabicum (Savul. & Rayss) Á. Löve
(2n=2x=14, E
b
E
b
) və Th. elongatum (Host) D.
(Dewey, 1984) (syn. Lophopyrum elongatum;
2n=2x=14, E
e
E
e
) kimi iki diploid növün daxil ol-
masını göstərir. Hər iki E
b
və E genom duzadavam-
lılıq (Dvorak and Ross 1986) və sünbülün fuzarioz
(Fusarium head blight) göbələk xəstəliyi daxil ol-
maqla bir neçə xəstəliyə davamlılıq (Shen and
Ohm, 2007; Qi et al., 2010; Zhang et al., 2002)
kimi arzu olunan aqronomik əlamətlərin mənbəyi-
dir. Thinopyrum bessarabicum Qara dəniz və Ara-
lıq dənizi bölgələrində 350 mM NaCl duzu qatılı-
ğında (Gorham et al., 1985) özünün həyat tsiklini
tamamlamaq qabiliyyəti olan təbii alaq otudur. Thi-
nopyrum bessarabicum (2n=2x=14, JJ yaxud E
b
E
b
)
duza tolerantlığına və xəstəliklərə davamlılığına gö-
rə buğdanın yaxşılaşdırıması üçün mühüm genetik
ehtiyatdır. Buğda-Th.bessarabicum translokasiya
xətləri onların buğdanın yaxşılaşdırılmasında prakti-
ki istifadəsini asanlaşdırmışdır. Tetraploid buğda
T.durum Desf. (2n = 4x = 28, AABB) və Th. bessa-
rabicum arasında çarpazlaşma nəticəsində alınmış
amfidiploid Tritipyrum (2n=6x=42, AABBE
b
E
b
)
buğdanın duzadavamlılığının yaxşılaşdırılması üçün
bu əlamətin introqressiyasında yeni potensiala ma-
lik amfidiploiddir (Alonso and Kimber, 1980; King
et al., 1997; Chetan et al., 2016). Triticeae ailəsinin
müxtəlif cins və növlərinin C-zolaqlı kariotipləşdi-
rilməsi aparılmış və bir çox növlərin genomlarının
fərdi xromosomları identifikasiya edilmişdir (Mir-
zaghaderi et al., 2010). Kariotip analiz məlumatları-
nın Triticeae ailəsinin xromosomlarının təkamül-
ünün analizində mühüm əhəmiyyəti vardır və buğ-
danın yaxşılaşdırılmasında yad xromosomların ge-
nom manipulyasiyasında əhəmiyyətlidir. Bəzi ilkin
məlumatlarda Th.bessarabicum xromosomlarının
sitogenetik identifikasiyası haqqında məlumat var-
dır (Endo and Gill, 1984; Jauhar 1992; William and
Mujeeb-Kazi, 1993). Lakin, bu analizlər bir metod-
la məhdudlaşmış və yaxud Th. bessarabicum və
Tritipyrum xromosomları üçün hər ikisi birlikdə tət-
biq olunmamışdır.
Genomun təyini üçün yeni tip markerlər (EST-
SSR, hədəf ardıcıllıqların expressiyası-sadə ardıcıl-
lıqların təkrarı) Thinopyrum bessarabicum, Т. elon-
gatum, Т. junceum xromosomları üçün hazırlanmış
və bu markerlərlə onlara aid olan xromosomlar üç
seriya buğda-Thinopyrum xətlərində aşkar edilmiş-
dir (Wang et al., 2010). EST-SSR markerlər genlə-
rin müqayisəli xəritələşdirilməsi, xromosomların iz-
lənməsi, taksonomik tədqiqatlar, genin introqressi-
yası və sortun identifikasiyası zamanı faydalıdır.
Həmçinin, bərk buğda Triticum durum x Thi-
nopyrum bessarabicum ilə hibridlərdə və Thinopy-
rum xromosomlu əlavə xətlərdə (monosomik yaxud
disomik) E
b
genomun xromosomlarının identifika-
siyası üçün molekulyar markerlər ( Xedm74 -1 E
b
,
Xedm8 -2 və 3 E
b
, Xedm54-5 E
b
, Xedm80 -6 E
b
və
Ə.Ç. Məmmədov
12
Xedm34-7 E
b
) işlənib hazırlanmış, lakin 4 E
b
xro-
mosomunu aydın xarakterizə edən marker tapılma-
mışdır (Ji-Yi et al., 2002; Jauhar, 1992; 2013).
Aparılan tədqiqat işi nəticəsində yoxlanılan
çoxlu sayda RAPD markerlər içərisindən Thinopy-
rum bessarabicum-un E
b
genomun 1E
b
və
4E
b
xro-
mosomları üçün əlavə, yeni 3E
b
və 6E
b
xromosom-
ların identifikasiyası üçün tamamilə yeni spesifik
RAPD markerlər müəyyən olunmuşdur. Bu RAPD
markerlər müxtəlif hibridlərin və ya xromosom əlavə
edilmiş xətlərin genomunda xromosomların identi-
fikasiyasında istifadə oluna bilər.
MATERİAL VƏ METODLAR
Bitki materialları
Yabanı çoxillik diploid buğda otu Thinopyrum
bessarabicum-un (Savul.
& Rayss) Á.Löve
(2n=2x=14; JJ yaxud E
b
E
b
genom) 1E
b
-dən 7E
b
qədər ayrı-ayrı xromosom cütlərinin heksaploid
yumşaq buğdanın Triticum aestivum L. “Chinese
Spring” (6n=6x=42; AABBDD genomlar) geno-
muna daxil edilmiş T.aestivum-un 7 disomik əlavə
olunmuş xətlərinin (CIMMYT, 2x=44) toxumları
Yem Bitkilərinin və Otlaqların Tədqiqi Laboratori-
yasının istixanasında, 20-24°C temperaturda, 16
saat işıq və 8 saat qaranlıq şəraitdə vegetasiya qab-
larında əkilərək (FRRL, Logan, Utah, USA becəril-
mişdir (Cədvəl 1).)
Yabanı buğda otu və yumşaq buğda cücərtilə-
rindən genom DNT-nin ayrılması
Yaşıl yarpaqlardan genom DNT-si CTAB
metodu ilə ayrılmışdır (Doyle and Doyle, 1990).
Yaşıl yarpaqlar fərdi yığılır, yuyulduqdan sonra filtr
kağızı üzərində qurudulur, 0.5 q xırda doğranmış
yarpaqlar 2 ml kreogen mühitə davamlı tyubun içə-
risinə pinsetlə yığılır və hər tyuba 2-3 ədəd kiçik
polad diyircək əlavə edilir. Plastik tyubun qapağı
möhkəm bağlandıqdan sonra ehtiyyatla içərisində -
186ºC maye azot olan plastik qaba yerləşdirilir.
Maye azota daxil edilmiş tyublar pinset vasitəsilə
çıxarılaraq Vortex aparatında maksimum 20-25 sa-
niyə müddətində çox yüksək sürətlə silkələnir, son-
ra isə təkrarən maye azota daxil edilir. Yarpaq toxu-
ması toz halına keçənə qədər bu proses bir neçə də-
fə təkrarlanır.
Öncədən hazırlanmış 2%-li CTAB (Cetyltri-
methylammonium bromide) ekstraksiya buferi (100
mM Tris- base, pH-8,0; 20 mM EDTA,pH-8,0; 1,4
M NaCl və 1% PVP -Polyvinylpyrralidone) su ter-
mostatında 60 ºC qızdırılır, 1 ml götürərək toz ha-
lına salınmış yarpaq toxumasının üzərinə əlavə
edilir və tyublar yenidən vorteksdə bir neçə saniyə
ərzində qarışdırılır. Polad diyircəklər maqnit vasitə-
silə tyubdan kənarlaşdırılır, hər bir tyuba 0, 4 ml
xloroform əlavə edilir və arabir astaca qarışdırılır.
Tyublar 60ºC temperaturlu su hamamında 10 dəqi-
qə müddətində inkubasiya edilir. İnkubasiya olun-
muş tyublar su hamamından çıxarılaraq 10 dəqiqə
ərzində 14000 dəq/dövr sentrifuqada çökdürülür.
Yeni steril tyublar əvvəlkilərə uyğun şəkildə nöm-
rələnir. Sentrifuqada çökdürülmüş qarışıqdan ayrı-
lan supernatant ehtiyatla yeni tyublara keçirilir.
Köhnə tyublar içərisindəki çöküntü ilə birlikdə eh-
tiyat DNT materialı kimi saxlanılır və təcrübə sona
çatana qədər atılmır. Supernatantın üzərinə 1ml
steril ucluqlu pipet ilə 0,6 ml soyuq izopropanol
əlavə edilir. Tyubu bir neçə dəfə çevirməklə qarış-
dırdıqdan sonra məhlulda çöküntüyə keçmiş DNT
müşahidə olunur. Steril qarmaqla DNT məhluldan
götürülür və hər birinin içərisinə 1 ml 70% etanol
əlavə edilmiş uyğun yeni tyublara daxil edilir.
Tyublar 10 dəqiqə müddətində 14000 dəq/dövr sen-
trifuqada çökdürülür. Çökmüş nüvə DNT 1 ml 70%
soyuq etanol ilə yuyulur. DNT molekulu ehtiyatla
etanolda qarışdırılır və təkrarən 5 dəqiqə ərzində
14.000 dəq/dövr sentrifuqada çökdürülür, bu mər-
hələ iki dəfə təkrar olunur. Sonda yenidən üzərinə
96% etanol spirti əlavə olunur, sentrifuqalaşdırılır
və tyubların qapağı açılaraq spirt atılır, dibində
DNT çöküntüsü olan tyublar filtr kağızının üzərinə
qapağı açılaraq etanolun tamamilə süzülməsi üçün
qoyulur. DNT evaporatorda 5 dəqiqə ərzində 37°C
qurudulur, üzərinə 300 µl soyuq TE bufer( 10 mM
tris-HCl, pH-8.0, 1 mM EDTA) və ya steril ddH
2
O
əlavə edilirək 4ºC temperaturda saxlanılır. Bu za-
man xromosom DNT-si normal həll olur.
RAPD marker ardıcıllıqları əsasında Wei və
Wang (1995), Zhang və b. (1998), və Li və b.
(1995) tərəfindən STS (qısa tandem ardıcıllıq) mar-
kerlər dizayn edililmişdir. Seçilmiş RAPD pray-
merlər Cədvəl 2-də verilmişdir.
NƏTİCƏLƏR VƏ ONLARIN MÜZAKİRƏSİ
Tədqiqatın aparılması üçün götürülmüş bitki
nümunələrindən ayrılmış xromosom DNT-nin qatı-
lığı spektrofotometrik təyin olunmuş və PZR apa-
rılması üçün hər bir DNT nümunəsi 20 nq/µL ol-
maqla steril ddH
2
O durulaşdırılmışdır. Bundan son-
ra cədvəl 1-də verilmiş bitki nümunələrinin duru-
laşdırılmış matrisa xromosom DNT ilə PZR aparıl-
mış və amplifikasiya məhsullarının analizi 2% aqa-
roza gelində aparılmışdır.
E
b
Genoma Malik Thinopyrum bessarabicum
13
Şəkil 1. Triticum aestivum (CS) / Tynopirum bessarabicum disomik əlavə olunmuş xətlərin genom DNT üzərində
OPAY05 RAPD markerlərlə aparılmış PZR nəticəsində alınmış amplikonların 2% aqaroza gelində elektroforetik
analizi. M- marker DNT (yuxarıdan aşağıya): 1500, 1200, 1000, 900. 800, 7000,600,500, 400,300,200 və 100 n.c.
Şəkil 2. Triticum aestivum (CS) / Tynopirum bessarabicum disomik əlavə olunmuş xətlərin genom DNT üzərində
OPAZ04 RAPD markerlərlə aparılmış PZR nəticəsində alınmış amplikonların 2% aqaroza gelində elektroforetik
analizi. M- marker DNT (yuxarıdan aşağıya): 1500, 1200, 1000, 900. 800, 7000,600,500, 400,300,200 və 100 n.c.
Şəkil 3. Triticum aestivum (CS) / Tynopirum bessarabicum disomik əlavə olunmuş xətlərin genom DNT üzərində
OPAZ11 RAPD markerlərlə aparılmış PZR nəticəsində alınmış amplikonların 2% aqaroza gelində elektroforetik
analizi. M- marker DNT (yuxarıdan aşağıya): 1500, 1200, 1000, 900. 800, 7000,600,500, 400,300,200 və 100 n.c.
Thinopyrum
bessarabicum (Savul.
&
Rayss)
Á.Löve E
b
genomu və onun hər bir xromosomu
ayrı-ayrılıqda (1E
b
-7E
b
) heksaploid Çin yazlıq buğ-
dasına introqressiya olunmuş xətlərin və T. aesti-
vum tərkibində Th.intermedium-un xromosom se-
qmentləri olan R və S genomlara malik xətlərin ge-
nomları üzərində (Cədvəl 2) verilən RAPD pray-
merlər ilə aparılan PZR nəticəsində sintez olunmuş
amplikonların elektroforetik analizinin nəticələri 3,
4, 5, 6 və 7 saylı cədvəllərdə verilmişdir. E
b
ge-
nomun 7 haploid xromosomu vardır və əvvəl apa-
rılan tədqiqatlar nəticəsində 52 təsadüfi götürülmüş
RAPD praymerlər içərisindən 5 disomik əlavə xət-
lərdə hər bir E
b
xromosom üçün bəzi xromosom-
spesific RAPD markerlər seçilmişdir. İlkin tədqi-
qatlarda məlum olan OPF03
1296
(Zang et al., 1996,
1998) daxil olmaqla 6 RAPD marker CS/T.bessa-
rabicum-un qismən amfidiploidlərdə və bütün 5 di-
somik əlavə xətlərdə müəyyən olunmuşdur.
OPAY 05
OPAZ04
OPAZ11
Ə.Ç. Məmmədov
14
Cədvəl 1. Tədqiqatda istifadə olunan bitki materialları
№
Simvollar
Növlər
IK No.
Mənbə
Qeyd
1
E
b
=J
Thinopyrum bessarabicum (Savul. & Rayss) Á. Löve
PI531710
FRRL
çoxillik
2
1 E
b
CS/Th. bessarabicum
W95002; (1114)
CIMMYT
3
2 E
b
CS/Th. bessarabicum
W95003; (1115)
CIMMYT
4
3 E
b
CS/Th. bessarabicum
W95004; (6788)
CIMMYT
5
4 E
b
CS/Th. bessarabicum
W95005; (1117)
CIMMYT
6
5 E
b
CS/Th. bessarabicum
W95006; (1112)
CIMMYT
7
6 E
b
CS/Th. bessarabicum
W95007; (6789)
CIMMYT
8
7 E
b
CS/Th. bessarabicum
W95008; (1110)
CIMMYT
9
ABD
Triticum aestivum L. “Chinese Spring” (CS)
Citr14108
Missouri
illik
10
P
107
(R)
T. aestivum tərkibində Th. intermedium xromosomu yaxud
seqment olan xətlər
P107, 6740
Purdue
11
T1(R)
T. aestivum tərkibində
Th. intermedium-un xromo-
som seqmenti olan xətlər
Y920592, 6741
Çin
12
T2(R)
Y920592, 6742
13
T3(S)
D957-3, 6743
14
T4(R)
6744
15
P
6
(R)
P29 = GP-541
16
P
7
(R)
169-1
17
P
8
(R)
632-21
18
P
9
(S)
177-1
19
P
10
(S)
69-1
Cədvəl 2. E
b
genomun hər bir xromosomunun təyini üçün seçilmiş RAPD praymerlərin siyahısı
№
E
b
genomun
xromosomu
Praymerlər
Praymerlərin nukleotid ardıcıllığı
PZR-n tərkibi, parametrləri və amplikon-
ların analizi
1
1 E
b
OPF-07
OPBA-17
OPB-03
OPJ-01
5'-CCGATATCCC-3'
5'-TGTACCCCTG-3'
5'- CATCCCCCTG-3'
5'-CCCGGCATAA-3'
Dekamer oliqonukleotidlər Operon Technol-
ogies Kompaniyasından alınmışdır.
GeneAmp PCR system 9700, 40 tsikl, 93°C 1
dəq, 35°C 1 dəq., 71°C 2 dəq., saxlanma 4°C.
AmpliTaq DNT Polymerazanın Stoffel fraq-
mentləri, 10
x
buffer və 25 mM MgCl
2
Perkim-
Elmer Kompaniyadan alınmışdır.
Amplifikasiya reaksiya qarışığının ümumi
həcmi 25µL təkil edir və hər bir PCR reaksi-
yanın tərkibinə 13.3 µL steril ddH
2
O, 2.5 µL
10
x
bufer, 2µL 8 mM dNTP, 2 µL 10µM
praymer, 3 µL 25 mM MgCl
2
, 0.2 µL
(2vahid) Stoffel fraqment və 2 µL matrisa
DNT (25nq/ µL) daxildir, və üzərinə 30
µLmineral yağ əlavə edilir.
Amplifikasiya məhsulları 2% aqaroza gelində
və tərkibində 0.5 µq etidium bromid olan
1xTBE buferində (pH8.3) elektroforetik ana-
liz edilmişdir. DNT fraqmentlərinin şəkili
UB-şüa altında çəkilmiş və onların ölçüləri
DNT ölçü markerləri ilə müqyisə olunmaqla
təyin edilmişdir.
2
2 E
b
OPD-12
OPP-04
5'-CACCGTATCC-3'
5'- GTGTCTCAGG-3'
3
3 E
b
OPC-03
5'-GGGGGTCTTT-3'
4
4 E
b
OPB-09
OPAA-11
OPAY-05
OPAZ-04
OPAZ-13
OPAZ-08
5'-TGGGGGACTC-3'
5'-ACCCGACCTG-3'
5'-TCGCTGCGTT-3'
5'-CCAGCCTCAG-3'
5'-CCCGAAGCAA-3'
5'-TCGCTCGTAG-3'
5
5 E
b
OPH-11
5'-CTTCCGCAGT-3'
6
6 E
b
OPF-12
OPAZ-11
OPAZ-02
5'-ACGGTACCAG-3'
5'-TCCAGCGCGT-3'
5'-CCTGAACGGA-3'
7
7 E
b
OPAZ-06
OPAZ-17
OPAY-13
5'-CCTTCGGAGG-3'
5'-CACGCAGATG-3'
5'-CCGCTCGTAA-3'
Yad xromosomun identifikasiyası üçün Cin
heksaploid yazlıq buğdasına T.aestivum-a T. bessa-
rabicum-un E
b
genomunun hər bir xromosomunun
ayrıca daxil edilməsi ən mürəkkəb və vaxt aparan
prosesdir. Morfoloji əlamətlər, xromosomların qab-
lanması texnologiyalarının və biokimyəvi marker-
lərin müəyyən çatışmazlıqları vardır və dəqiqlikləri
aşağıdır. Molekulyar metodlardan öncə yad xromo-
somların genomda olmasının aşkar edilməsində
GISH metod ilk addımdır və bu yad xromosomların
müxtəlif homoloji qruplara ayrılmasında tətbiq oluna
bilər. E
b
genomu nisbətən yumşaq buğdanın ABD
genomuna (xüsusilə D genoma) yaxın olduğu üçün
E-genomun xromosomlarının buğda xətlərində aşkar
edilməsində St genomun GISH metod üçün zond
kimi götürülməsi daha yaxşı olar (Wang et al., 1996;
Zhang et al., 1996; Chen et al., 1998). Bu texnikalar-
dan istifadə olunmaqla müəyyən edilmişdir ki, təd-
qiq olunmuş 7 xətdən 6 xətt həqiqi əlavə olunmuş di-
somik xətdir, biri isə üçlü disomik əlavə xətdir.
E
b
Genoma Malik Thinopyrum bessarabicum
15
Cədvəl 3. Triticum aestivum (CS) / Tynopirum bessarabicum disomik əlavə olunmuş xətlərin genom DNT üzərində
RAPD markerlərlə aparılmış PZR nəticəsində sintez olunmuş müxtəlif ölçülü amplikonların 2% aqaroza gelində el-
ektroforetik analizin nəticələri
№ Xətlər Kod OPBA17
Dostları ilə paylaş: |