AZƏRƏbaycan miLLİ elmlər akademiyasi zoologiya institutu

Yarım aləm: Protozoa

Tip. Apicomplexa

Sinif: Sporozoasina

Yarım sinif: Coccidiasina

Dəstə: Eucoccidiorida

Fəsilə: Sarcosystidae

Cins: Sarcocystis

Sarcocystis cinsinə daxil edilən növlər son sahiblərinə nisbətən aralıq sahibləri daha spesifikdir. İtlər tərəfindən ötürülən hər hansı bir növ pişiklər tərəfindən ötürülə

bilməz.

Ot və qarışıq qida ilə qidalanan heyvanlar bu parazitlərin inkişafında aralıq, ət yeyən heyvanlar isə əsas sahib rolunda çıxış edirlər.

Sarcocystis cinsinə daxil edilən növlər hüceyrə daxili ibtidai parazitlər olub, həyat dövriyyəsi cinsiyyətli və cinsiyyətsiz olmaqla növbələşir və üç mərhələyə bölünür:

1.Sporoqoniya

2.Şizoqoniya

3.Qametoqoniya

Sporoqoniya zamanı aralıq sahibi yoluxdurmaq xüsusiyyətinə malik sporozoitlər əmələ gəlir. Şizoqoniya cinsiyyətsiz çoxalma mərhələsi olub, bu zaman bir neçə dəfə bölünmə baş verir. Son sahibdə gedən qametoqoniya mərhələsi isə qametlərin mayalanması, birləşməsi ilə baş verən mərhələdir.

Hər hansı bir əsas sahib Sarcosystis spp. ilə yoluxan toxumada olan yetişmiş sarkosistaları ilə udduqda yoluxur (şəkil 3.1). Ət ilə birlikdə əsas sahibin həzm sisteminə düşən yetkin sarkosistaların divarı həzm sistemi fermentlərinin təsirindən partlayır, azad olan sporozoitlər nazik bağırsağın xovlarına daxil olur ki, burda bir müddətdən sonra makro – və mikroqametlərin əmələ gəlməsi ilə müşaət olunan qametogenez prosesi baş verir. Nazik bağırsaqda qametoqoniya və sporoqoniya mərhələsindən sonra, hər birində dörd sporozoid olan iki sporosista əmələ gəlir. Sporosistalar ətraf mühitə fekal vasitəsi ilə düşür.

Qeyd etmək lazımdır ki, aralıq sahibin həyatında bir dəfə 1 sporosistanın udulması kifayət edir ki, bütün həyatı boyu sarkosporidilər ilə yoluxmuş vəziyyətdə olsun. Əgər heyvan həyatında vaxtaşırı olaraq sarkosporidilərin sporosistalarını qəbul edirsə onda invaziyanın intensivliyi də daim artır. Onun üçün də əzələlərdə yaşlı sarkosistalar ilə yanaşı cavan sarkosistalara da təsadüf edilir. Aralıq sahibin toxumasında son sahibləri yoluxdurmaq üçün Sarcocystis-lərin “yetişməsi” növdən asılı olaraq 2 aya qədər davam edir.

Sporlaşmış oosista bir qatlı membrana, nüvəyə, endoplazmatik şəbəkəyə, mitoxondri, ribosom və holci kompleksinə malikdir [86]. Sporlaşmış oosista rəngsiz,

Şək. 1.1. Sarcocystis növlərinin ümumiləşdirilmiş həyat dövriyyəsinin sxemi [86].

qalın divarlı olub, iki uzun formalı sporosistaya malik olub, hər sporosistada da banan şəkilli və bütün ultrastruktura malik 4 sporozoit olur [86].

Ədəbiyyatlarda yoluxmanın süd vasitəsilə olması fikrinə [93] və İribuynuzlu heyvanlarda “anadan gəlmə” sarkosistoz haqqında məlumatlar verilsə də yeni doğulan heyvanlarda və ya döldə sarkosistaların olmasını sübut edən faktlar yoxdur.

Əsas sahibin ifrazatı ilə ətraf mühitə düşən sporosistalar aralıq sahib tərəfindən yem, su və ya hansı bir mümkün olan yollarla udulduqda, bağırsaqda həzm sistemi fermentlərinın təsirindən onun divarları həll olaraq partlayıb sporozoitlərdən azad olur.

Hərəkətli sporozoitlər bağırsağın epiteli hüceyrələrindən miqrasiya edərək arteriyaya daxil olur. Sporosistaların orqanizmə düşməsindən təxminən 15-16 gün

sonra, burada şizoqoniya və ya meroqoniya mərhələsi keçərək morfoloji quruluşuna görə sporozoit və brandizoitlərə oxşar çox saylı merozoitlər əmələ gətirir [93].

15 gündən sonra baş verən ikinci nəslin inkişafı endoteldə - kiçik kapillyarların divarlarında baş verir. İkinci nəslin şizontlarından azad olan merozoitlər qan damar sistemində sirkulyasiya olunaraq bölünüb 2 nəsil verir. Ümumiyyətlə, onun neçə nəsil verdiyi haqqında dəqiq məlumat yoxdur. Lakin, qanda 3 nəsil meroqoniyanın baş verdiyi haqında az sayda mənbələrdə məlumatlar verilir [86].

İkinci nəslin şizontlarından azad olan merozoitlər qan damarlarından əzələ və sinir toxumalarına daxil olaraq sistaları əmələ gətirir.

Meroqoniyadan sonra sarkosistaların tam formalaşması bir qayda olaraq ürək əzələsində, dildə, qida borusunda diafraqmada, skelet əzələlərində, bağırsaqda, ürəyin Purkine liflərində, bəzi hallarda isə sinir toxumalarında baş verir [120, 67, 94, 79]

Sarkosistaların ölçüləri sahibin toxumasının tipindən, sistaların formalaşma mərhələsində və parazitin növündən asılı olaraq dəyişə bilər. Məsələn, S.bovicanis-in sarkosistalarının ölçüsü 500 mkm, S.bovifelis-in isə 8 mm uzunluğunda ola bilər. S.gigantea-nın (=S.bovifelis) makrosistalarının ölçüsü isə 1sm və ya ondan da artıq ola bilir.

Müxtəlif tədqiqatçıların tədqiqatlarının nəticələrinə görə merontların və sporo-sistaların forma və ölçüləri də onların yaşından, onların sahibdə lokalizasiya olunduğu hüceyrənin tipindən asılı olaraq dəyişə bilər. Məsələn, eyni sahibin ürək əzələsi və mərkəzi sinir sistemində tapılan eyni Sarcocystis növünün sistalarının ölçüsü əzələ toxumasında təsadüf edilən sistaların ölçüsündən kiçik olur. Sarkosistaların ölçüsü tətbiq edilən metoddan və fiksatorun təsirindən variasiya edə bilər (adətən onların ölçüləri fiksasiya olunan toxumada canlı toxumada olan ölçüsündən kiçik olur). Bradizoitlərin ölçüləri də müxtəlif faktorların təsirindən dəyişə bilər. Dubey bunu əsas götürərək növün identifikasiyasında bu kriteriyalardan istifadə edilməsini məsləhət bilmir [86]. O göstərir ki, hüceyrə orqanoidlərinin strukturu növün təyinində kriteriya kimi çox ehtiyatla istifadə edilməlidir. Bunu, Fayer sistanın divarının strukturunun fiksatorun və parazitin lokalizasiya olunduğu sahibin orqanının hüceyrəsinin təsirindən dəyişə bilməsi ilə izah edir. Məsələn, S.cruz-nin sporosistalarının hamar divarı fiksatorun təsirindən qalınlaşa və girintili-çıxıntılı ola bilər.

Sarkosporidilər ilə yoluxan insanlardan götürülən nümunələrin elektron mikroskopik müayinəsindən məlum olmuşdur ki, Sarcocystis-lərin sistalarının divarı bir-birindən fərqlənən 7 struktura malikdir. İşıq mikroskopunda isə onun divarının bir qatlı olduğu görünür [94].

Radçenko və Qaibova sahibin əzələlərində Sarcocystis növlərinin sarkosistalarının uzun müddət mövcud olmasını onların struktur xüsusiyyətləri ilə əlaqədar olduğunu qeyd edir. Onlar göstərirlər ki, sarkosistalar xaricdən spesifik çıxıntılara malikdir. Bu çıxıntılar çoxsaylı fibrilyar struktura malik olub, bu sarkosistaların ancaq formasının saxlanılmasını təmin etməyib, əsasən parazit (sarkosista) ilə sahibın hüceyrələri arasında mübadiləni təmin edib, maddələrin hüceyrələrdən sarkosistaya və əksinə daşınmasını təmin edir [49].

Son illərdə Radçenko və Beyer 4 növ sarkosporidinin (Sarcocystis muris, S.medusiformis, S.fusiformis və ev camışlarının – Bubalus bubalus ürək əzələsində tapılan Sarcocystis spp.) sarkosistalarının səthinin quruluşunu müqayisəli şəkildə öyrənərək müəyyən etmişlər ki, bütün tədqiq edilən növlər membran səthinə, tərkibinə qlikokaliks daxil olan membran üstü və iki membran qatdan ibarət membran kompleksinə malikdir. Sarkosistalar bütün səthi boyu çökəkliklər ilə növbələşən şarabənzər çıxıntılara, membrandan əmələ gələn çıxıntılar da öz növbəsində membranüstü kompleksə və qlikoprotein qata, çökəkliklər isə nə membran kompleksinə nə də membran qatına malikdir. Membran səthinə malik olan bu sahələrdə sahibin hüceyrələri ilə mübadilə prosesləri baş verilir [51].

Müəyyən edilmişdir ki, bəzi Sarcocystis növlərinin (S.atlanticae, S.dugesii, S.gallotiae, S.stehlinii, S.simonyi, S.muris, S.rodentifelis, S.cymruensis) inkişaf tsiklində - cinsiyyətli və qeyri cinsiyyətsiz mərhələ eyni növ sahibdə başa çatır [115, 119].

Sarkosistaları kərtənkələlərin quyruğunda lokalizasiya olunan S.galoti-nin inkişaf tsikli daha maraqlıdır. Müxtəlif təhlükələr zamanı düşmənindən qaçmaq məqsədilə kərtənkələlər tərəfindən atılan quyruğu, düşməni tərəfindən udulur. Sarkosista ilə udulan belə quyruqda olan əzələ sistaları (sarkosistalar) həzm sisteminə düşdükdən sonra sista qamontlardan azad olur. Sonra oosistaların və sporosistaların yaranması ilə müşayət olunan, qametlərin kopulyasiyası baş verir. Beləliklə, bu halda eyni kərtənkələ həm aralıq və həm də son sahib rolunda çıxış edir [106].

1.3. Sarkosporidioz zamanı parazit-sahib münasibətlərinin biokimyəvi xüsusiyyətləri
Sarkosporidiozun öyrənilməsindən 150 ildən artıq vaxt keçməsinə baxmayaraq tədqiqatçılar hələ də bir çox çətinliklər ilə rastlaşırlar. Sarcocystis spp. tapılması və identifikasiyası və həmçinin bu növlərin sahibə görə genetik müxtəlifliyinin qiymətləndirilməsi üçün son illər müxtəlif molekulyar metodlar işlənib hazırlanmışdır [161, 133, 79, 125, 113, 127, 149, 90, 102, 96, 76].

Son zamanlar Sarcocystis spp. tapılmasında və identifikasiyasında növlərin

sahiblərinə görə genetik müxtəlifliyinin qiymətləndirilməsində bütün dünyada molekulyar diaqnostika metodlarına üstünlük verilir [162, 104, 149, 146].

Aralıq sahiblərdə xəstəliyin əlamətlərinə əsasən sarkosistozun varlığı haqqında fikir söyləmək olduqca çətindir. Son zamanlar canlı heyvanlarda xəstəliyə daha dəqiq diaqnoz və analizlər üçün biopsiya materialları alınaraq molekulyar genetik metodlardan istifadə etməklə aparılır. Lakin, bu metodların çətin, baha başa gələn və çox vaxt aparandır. Eyni zamanda belə analizlərin aparılması üçün müasir molekulyar laboratoriyaların olması zəruridir. Sarkosistozların təyinində müxtəlif diaqnostika metodlarından - histoloji, hematoloji, seroloji, immunoloji və s. istifadə olunur [107, 122, 45]. Bu metodlar içərisində sarkosistozun təyinində ən çox istifadə edilən metod seroloji metoddur. Əsasən İFA (Indirekt Fluoresan Antikor), İHA (İndrekt Hemaglutinasyon), ELİSA (Enzim Linked İmmunosorbent Assay) testlərindən və PCR (Polimeraz Change Reaction) metodlarından istifadə edilir [164, 112, 69].

Sarcocystis spp. diaqnostikasında istifadə edilən sadə və ucuz metod ölən və ya kəsilən heyvanların toxumalarının mikroskopik və vizual diaqnostika və hemato-kslinin eozin ilə boyama – histoloji metodudur [111]. Bununla belə daha mürəkkəb və baha başa gələn antitel testi kimi metod da mövcuddur [125].

Növlərin identifikasiyasında uzun illər ərzində elektron mikroskopiya üsulundan istifadə edilmişdir. Çünki işıq mikroskopunun böyütmə imkanlarının növlər arasında olan fərqlərin müəyyənləşdirməyə imkan vermədiyindən növlərin identifikasiyasında işıq mikroskopundan istifadə edilməsi demək olar ki, mümkün deyil. Lakin bütün bunlara baxmayaraq koksidilərin tədqiqində işiq mikroskopiya metodu asan və ucuz olduğundan fekal nümunələrində və toxumalarda sistaların aşkara çıxarılmasında öz əhəmiyyətini hələ də itirməmişdir. Bu metod vasitəsilə alınan məlumatlardan növbəti molekulyar səviyyədə analizlərdə istifadə edilir.

Hüceyrə daxili parazitizmdə koksidilərin təsiri onun sahib orqanizmə biokimyəvi, immunoloji və s. təsir ilə xarakterizə olunur. Müasir təsəvvürlərə görə parazit və onun sahibinin arasında qarşılıqlı molekulyar mexanizmlər – molekulyar mimikriya, sahibin siqnallarının tutulması, molekulyar inteqrasiya və s. mövcuddur [74].

Sahibin hüceyrəsi parazitin yaşayıb fəaliyyət göstərməsi üçün substrat rolunda çıxış edir. Bu zaman heç də sahibin hüceyrəsi onun daxilində olan parazitə münasibətdə passiv deyil. İki antaqonist arasında parazit- sahib münasibətləri üç formada özünü göstərir: sahibin hüceyrəsi paraziti məhv edir; parazit sahibin hüceyrəsini məhv edir; onlar arasında müvəqqəti tarazlıq yaranır [11, s.111]. Belə ki, parazit sahibin bütün hüceyrələrinə daxil ola bilmir, sahibin hüceyrəsi öz “müdafiə sistemini” işə salaraq ondan azad olmağa çalışır.

Parazit sahibdən bəzi metabolik yollarının oxşar olmaması ilə fərqlənir. Belə ki, parazit sahibin metabolizmindən onun üçün lazım olan çox saylı komponentləri (purinlər, yağ turşuları, stirollar, aminturşular və s.) alır və həmçinin özünün metabolizminin son məhsullarını kənarlaşdırmaqda istifadə edir. Bunlar ilə yanaşı məlumdur ki, parazitlər onlar üçün lazım olan bütün maddələri hazır şəklidə almır. Onların bir çoxu parazitin özündə sintez olunur. Ona görə də həmişə sahibin metabolizmi ilə parazitin metabolizmi arasında fərqlər vardır. Mübadilə proseslərinin əsas metabolik yolları isə həm sahib və həm də parazit üçün eynidir.

Bu baxımdan heyvanların sarkosporidiozu öyrənilməsi müxtəlif aspektlərdən, parazitar xəstəliklərin biokimyəvi cəhətdən öyrənilməsi isə aşağıdakı istiqamətlərdə aparılır: 1) Parazitin özündə gedən biokimyəvi proseslərin öyrənilməsi, 2) sahibin maddələr mübadiləsinə parazitin təsiri, 3) hər iki tərəfin birgə yaşamasının mexanizmlərinin öyrənilməsi.

Sarkosporidioz zamanı parazit-sahib münasibətlərinin mürəkkəb mexanizm-lərinin aydınlaşdırılmasında istifadə olunan sitokimyəvi metodların köməkliyi ilə inəklərin miokardından ayrılan S.bovicanis sistalarında qlikoliz fermentləri [37], camışların qida borusundan ayrılan S.fusiformis sistalarından ümumi lipidlər, fosfolipidlər, piy və yağ turşuları ayrılmışdır. Eyni zamanda tədqiq edilən toxumlarda asetilxolinesterazanın və qlutamatoksalasetettransferazanın aktivliyinin öyrənilməsi nəticəsində müəyyən edilmişdir ki, qlutamatoksalasetetransferazanın aktivliyi qlutamatpiruvattransaminazanın aktivliyindən yüksəkdir [77].

İmmunoloji metodları tətbiq etməklə sarkosistozun profilaktikasında istifadə edilməsi üçün siçanlardan ayrılan S.muris sistalarının səthindən ayrılmış antigenlər identifikasiya olunmuş, qoyunlarda parazitlik edən S.gigantea -nın isə antigenlərinin ayrılmasına cəhd edilsə də müsbət nəticələr alınmamışdır [87, 58].

Ədəbiyyat məlumatlarının analizi göstərir ki, sarkosporidilərin və onların sahiblərinin metabolizminin öyrənilməsi nəticəsində əldə edilən məlumatlar hələ

kifayət deyil.

S.fusiformis sistalarından və onların daxilində olan parazitin orqanoidlərindən hazırlanmış yaxmalarda qallosianinlə rəngləmə zamanı parazitin merozoitlərinin nüvələrində dezoksiribonuklein turşusu, qallisianin və prioninlə rəngləndikdə isə sitoplazmatik ribonunklein turşusu müəyyənləşdirilmişdir [17].

S.bovicanis sistalarının qılafında və septalarında turş fosfatazanın olduğu, zoitlərdə isə bu fermentin olmadığı müəyyən edilmişdir. Belə hesab edirlər ki, turş fosfataza sistaların qidalanmasında və degenerasiyasında istifadə olunur [37]. Chaudhry və b. isə septalarda turş fosafatazaya təsadüf etmədiklərini qeyd edir [77].

S.fusiformis-in yaş və quru sistalarında qlükogenin miqdarı Chaudhry və b. tərəfindən öyrənilmişdir. Onlar müəyyən etmişlər ki, yaş sistalarda qlükogenin miqdarı yaş çəkinin 0,71%-ni, qurudulmuş sistalarda isə quru çəkinin 6,46%-ni təşkil edir [77].

Sarkosporidilərin və sarkosporidiozların biokimyasının öyrənilməsinə dair məqsədyönlü tədqiqatlar AMEA zoologiya institutunda AMEA-nın müxbir üzvü, prof. Y.Y.Yolçiyevin rəhbərliyi altında aparılmışdır.

Laboratoriya əməkdaşları tərəfindən qoyunlarda parazitlik edən S.gigantea və camışlarda parazitlik edən S.fusiformis sistalarının inkişaf mərhələsində amin turşu tərkibi müqayisəli şəkildə öyrənilmiş və müəyyən edilmişdir ki, hər iki parazitin sistalarının zülalları eyni aminturşularından ibarət olub, 5 amin turşunun miqdarına görə fərqlənir [41].

Bu parazitlərin sistalarında sərbəst aminturşuların metabolitləri də öyrənilmişdir. Hər iki parazitin (S.gigantea və S.fusiformis) sistalarında 34 amin turşu və onların metabolitləri müəyyənləşdirilmişdir. Müəlliflərin fikrincə bu növlər metabolik cəhətdən yaxın olmalarına baxmayaraq müxtəlif heyvanlarda parazitlik etməyə uyğunlaşmışlar [41].

Musayev və b. (1986) və Bağırzadə (1989) S.fusiformis və S.gigantea növlərinin sistalarında DNT-nin miqdarını öyrənmişlər. Onlar göstərirlər ki, sistalar yetkinləşdikcə onlarda DNT-nin miqdarı artır. Eyni yetkinlik dərəcəsində olan S.fusiformis və S.gigantea sistalarında DNT-nin miqdarı S.gigantea sistalarında daha çoxdur [40, 9]. Bu parazitlərin sistalarında DNT-aza II fermentinin də aktivliyi öyrənilmişdir. Müəyyən edilmişdir ki, DNT-aza II fermentinin fəallığı sistaların yetkinlik dərəcəsindən asılı olaraq artır [40].

S.Mahmudov S.fusiformis və S.gigantea sistalarında ümumi zülal və zülal fraksiyalarını öyrənərək müəyyən etmişdir ki, sistaların ümumi zülalının miqdarı 19,21-19,50q% arasında olub, aralıq sahiblərdə məskunlaşdığı orqanlardakı (qida borusu (17,98-18,37q%)) ümumi zülalın miqdarından əsaslı fərqlənmir [2].

Sarkosporidioz zamanı heyvanların qanında AST, ALT, qələvi və turş fosfatazaların aktivliyi artır [46], qlükogenin miqdarı isə qaraciyərdə azalır [13].

Sarkosporidilərin sahib heyvanın metabolizminə təsirinin öyrənilməsinə həsr olunmuş tədqiqat işlərinin nəticələrinin analizi göstərir ki, xəstəlik samanı sahibin orqanizmində əsaslı biokimyəvi və fizioloji dəyişkənliklər baş verir.

Sarkosporidilərin və sarkosporidiozların biokimyasının öyrənilməsinə həsr edilən tədqiqat işləri kifayət qədər deyil. Xüsusilə, yoluxmuş heyvanların zülal mübadiləsinin öyrənilməsinə həsr edilən işlər azdır.

II FƏSİL

MATERİAL VƏ TƏDQİQAT METODLARI
SARKOSPORİDİLƏRİN TƏDQİQİNDƏ İSTİFADƏ

EDİLƏN METODLAR
2.1.Nümunələrin toplanması və preparatların hazırlanması metodları
Dissertasiya işi 2008-2014-cü illərdə Azərbaycan Milli Elmlər Akademiyası Zoologiya institutunun parazit-sahib münasibətlərinin biokimyəvi əsasları laboratoriyasında yerinə yetirilmişdir.

Tədqiqat üçün materiallar Böyük Qafqaz fiziki-coğrafi vilayəti (Abşeron, Şamaxı, İsmayıllı, Şəki, Zaqatala, Balakən, Şabran rayonları), Kür çökəkliyi fiziki-coğrafi vilayəti (Bərdə, Sabirabad, Saatlı, İmişli, Beyləqan, Biləsuvar rayonları), Kiçik Qafqaz fiziki-coğrafi vilayəti (Gədəbəy rayonu) və Lənkəran fiziki-coğrafi vilayətinə (Yardımlı, Lerik, rayonları) daxil edilən rayonlarda fərdi təsərrüfatlarda saxlanılıb kəsilən müxtəlif yaşdan olan qoyunlardan götürülmüşdür.

Kəsilən qoyunların ürəyi, qaraciyəri, dalağı, dili, qida və tənəffüs boruları, boyun və qarın əzələləri, diafraqması sarkosporidilərin makro və mikrosistaları ilə yoluxması vizual və mikroskopik üsulla yoxlanmışdır. Toxumaların daxilində makrosistaların olduğunu aşkar etmək üçün onlar lanset vasitəsilə şırımlara ayrılmış və müayinə edilmişdir.

Qoyunlardan götürülən toxuma nümunələrində mikrosistaların olduğunu müəyyən etmək üçün kompressori metodundan istifadə edilmişdir. Bunun üçün hər orqandan çəkisi 50 q olan 5 toxuma nümunəsi götürülmüş, bu da öz növbəsində qayçı vasitəsilə kiçik hissələrə doğranmışdır. Kəsiklərin üzərinə 2-3 damcı (bərabər hissədə 0,5%-li metilen göyünün sulu məhlulu ilə buzlu sirkə turşusu məhlulunun qarışığı) qarışıq əlavə edilmişdir. 5 dəqiqədən sonra onun üzərinə 2-3 damcı 25%-li naşatır spirti məhlulu əlavə edilmiş, sonra təxminən buğda dəni ölçüsündə kəsilib götürülən hissələr kompressorumda sıxılaraq mikroskopun kiçik böyüdücüsü (7x8) altında baxılmış, toxumalarda mikrosistalar aşkar etdikdə onların fotoşəkilləri çəkilmişdir. Mikroskopik tədqiqat zamanı hər kəsikdə sarkosistaların sayı nəzərə alınmış, invaziyanın intensivliyi 1 kəsikdə olan sarkosistaları saymaqla qiymətləndirilmişdir. İnvaziya şərti olaraq belə qruplaşdırılmışdır: yüksək (1 kəsikdə 12 və 12-dən çox sarkosista olduqda), orta (1 kəsikdə 9-11 sarkosista olduqda), zəif (1 kəsikdə 9-ə qədər sarkosista olduqda).

İnvaziyanın ekstensivliyi bütün yoxlanılmış heyvanlar arasında xəstə heyvanların sayına görə, intensivliyi isə mikrosistalar üçün 1 kəsikdə olan sistaların sayına, makrosistalar üçün isə 3sm² toxuma kəsiyində tapılan sistaların sayına görə hesablanmışdır.


2.2. Sarkosporidilərin toxumalardan ayrılması və onların təmizlənməsi metodları
Heyvanların yoluxmuş orqanlarının toxumalarından mikrosistaların ayrılması üçün heyvanlar intensiv yoluxduqda bir heyvandan, zəif yoluxduqda isə bir neçə heyvandan götürülən nümunələr (qaraciyər, ürək, qida borusu, diafraqma, gövdə əzələləri və s.) ayrı-ayrılıqda ət maşınından keçirilib, alınan farşdan mikrosistaların ayrılması üçün mədə şirəsində əzələlərin həll edilməsi metodundan istifadə edilmişdir [36, s.13]. Bu məqsədlə süni mədə şirəsi hazırlamaq üçün 3q pepsinin 1000 ml suda həll edildikdən sonra onun üzərinə 1q qatı hidrogen xlorid turşusu əlavə edilmişdir. Yaxşı-yaxşı qarışdırılan farşdan 10q götürərək 1:25 nisbətində süni mədə şirəsində 42-47⁰C temperaturada termostatda 3,5-4,0 saat saxlanılmışdır. Alınan suspenziya torunun ölçüsü 600-700 mkm olan ələkdən, keçirilərək 7000 dövr/dəqiqə sürətlə 10 dəqiqə sentrifuqa edilmişdir. Çöküntü mikroskopun əşya şüşəsi üzərinə əlavə edilərək mikroskopun böyük böyüdücüsü (x100) altında baxılmışdır.

Çöküntüdə mikrosistalar aşkar edildikdə nümunələr biokimyəvi analizlər üçün hazırlanmışdir.

Sağlam, kontrol heyvanların orqanlarından götürülən nümunələr biokimyəvi analizlər üçün aşağıdakı qaydada hazırlanmışdır. Toxumaların əzilməsində şüşə homogenezatordan istifadə edilmişdir. Bunun üçün toxuma kütləsi 1:10 nisbətində (kütlə/həcm) fizioloji məhlula yerləşdirilmiş, 10 dəqiqə müddətində homogen kütlə alınana qədər əzilmişdir. Homogenezator firlanan zaman toxumanın qızmasının qarşısını almaq üçün homogenezator buzlu suya yerləşdirilmişdir. Bu qaydada hazırlanan homogenant 30 dəqiqə 18000 dövr/dəqiqə sentrifuqa edilmişdir. Alınan supernatantdan biokimyəvi tədqiqatlarda istifadə edilmişdir.


2.3. Ümumi zülal və zülal fraksiyalarının təyini üsulları
Yuxarıda göstərilən qaydada müayinələr üçün hazırlanan supernatantlarda, qan zərdabında ümumi zülalın miqdarı Louri metodu [18] ilə təyin edilmiş, nəticələr isə q/l ilə ifadə edilmişdir.

Parazitin sistalarının, sahibin orqanlarının və qan zərdabının zülallarının fraksiyalara ayrılmasında poliakrilamidgel elektroforez metodundan istifadə edilmişdir [81, 35].

Zülalların fraksiyalarına ayrılmasında 7%-li (pH8,9) narındanəli geldən, elektrod buferi məhlulu kimi isə 1:10 nisbətində bidistillə suyu ilə duruldulmuş TRİS-qlisin (pH8,3) buferindən istifadə edilmişdir. Zülalların fraksiyalara ayrılması üçün brom fenol göyünün ayrıcı gelə daxil olan anına qədər 120V, sonra isə 300V gərginlik verilmişdir. Elektrodlar platindən olmuş, zülalların fraksiyalarına ayrılmasına ümumilikdə 3 saat vaxt sərf edilmişdir.

Gellərin boyanmasında 7%-li buzlu sirkə turşusunda hazırlanmış 0,5%-li qara amiddən (amido blac) istifadə edilmişdir. 7%-li buzlu sirkə turşusu məhlulunda tam yuyulan gellərin UT-7608 (Latvia, Tartu) densitometrində densitoqrammaları yazılmış, boyanmış zülal fraksiyalarının yerinə görə onların elektroforetik hərəkət sürəti (EHS və ya R_f) hesablanmışdır. R_f –in hesablanmasında aşağıdakı düsturdan istifadə edilmişdir:

(2.1)
Burada: R_f – elektroforetik hərəkət sürəti (EHS),

L – gelin ümumi uzunluğu, mm ilə,

L_n- gel üzərində hər bir fraksiyanın ayrılıqda getdiyi yolun uzunluğu, mm-lə.

Densitoqrammalar üzərində zülalların miqdarını əks etdirən əyrilərin (piklərin) sahəsi aşağıdakı düsturla hesablanmışdır:

(2.2)

Burada: A - əyrinin (pikin) sahəsi,

h – densitoqramma üzərində əyrilərin hündürlüyü, mm ilə,

a- densitoqramma üzərində əyrilərin eni, mm ilə.

Fraksiyalarda olan zülalların miqdarı onların hamısının ümumi cəminə görə faizlə ifadə edilmişdir.

S.tenella sistalarında ümumi zülal və zülal fraksiyalarını öyrənmək üçün parazitin sistaları toxumalardan ayrıldıqdan sonra 4,5%-li natrium hipoxlorid məhlulunda, otaq temperaturunda bir sutka saxlanıldıqdan sonra 5 dəqiqə müddətində 1500 dövr/dəqiqə sürətlə sentrifuqa olunaraq natrium hipoxlorid məhlulundan təmizlənmişdir. Tam təmizlənib yuyulmuş, biokimyəvi tədqiqatlar üçün hazırlanmış mikrosistaların üzərinə 5ml TRİS qlisin buferi (pH 8,3) əlavə edilib УЗДН-1 ultrasəs disperqatorunda 22 KqH tezlikdə (300Vt) 10 dəqiqə 1 dəqiqə fasilələrlə dağıdılmışdır. Alınan homogenantlar 30 dəqiqə müddətində 18000 dövr/dəqiqə sentrifuqa edilmişdir. Sentrifuqalamadan sonra alınmış supernatantdan zülalların fraksiyaya ayrılmasında, ümumi zülalın miqdarının və fermentlərin aktivliyinin təyin edilməsində istifadə edilmişdir. Elektroforez prosesi aparılan zaman elektrod buferi kimi tərkibində 10% dodesilsulfat natrium olan TRİS-qlisin buferindən (pH 8,3) istifadə edilmişdir, elektrodlar isə platindən olmuşdur.

Tam yuyulmuş gellərdə olan zülal fraksiyalarının densitoqrammaları və sxematik şəkilləri çəkildikdən sonra onların molekul çəkiləri təyin edilmişdir.

Zülal fraksiyalarının molekul çəkisini təyin etmək üçün “Sigma” firmasının istehsalı olan “Molecular weight marker kit”-dən istifadə edilmişdir. Bu məqsədlə molekul çəkisi məlum olan zülal qarışığının elektroforezi aparılmışdır. Bu zaman molekul çəkisi məlum olan “markör” zülallar karbon anhidraza (29000 Dalton), yumurta albumini (45000 Dalton), qaramal albumini (66000), b-fosforilaza (97400 Dalton), β-qaloktosidaza (116000 Dalton) və dovşan əzələsindən alınan miozin (205000 Dalton) olmuşdur.

Densitoqrammalar üzərində markör və təcrübə zülallarının fraksiyalarının elektroforetik hərəkət sürətləri hesablandıqdan sonra əldə edilən məlumatlar əsasında qurulan qrafikə (şək. 2.1) əsasən zülalların molekul çəkiləri hesablanmışdır.