Bob. Genomlarni tahrirlash

CRISPR texnologiyasi

TALEN ximerik oqsillari tizimi kashf qilinganidan ikki yil o’tib CRISPR genomni tahrirlash texnologiyasini faol qo’llash rivojlandi.
1 Bu texnologiyaning elementlari kodirlamaydigan RNK va Cas (CRISPR- associated) oqsillari hisoblanadi. TALEN ximerik oqsillaridan farqli ravishda CRISPR/Cas tizimi yordamida xususiyati nishonlangan DNK va kodirlamaydigan RNKlarning o’zaro komplementar bog’lanishi hisobiga amalga oshiriladi. Bunda nukleaza faolligiga ega kodirlamaydigan RNK va Cas oqsillaridan iborat kompleks hosil bo’ladi. Ba’zi bakteriya genlarida 1987 yilda sirli takrorlar aniqlangan, ularning funksiyalari qariyb 20 yil davomida noma’lumligicha qoldi. Bakteriya genlarining sekvens qilinishi genomda analogik nukleotid ketma-ketligiga ega bo’lgan ko’plab mikroorganizmlarning aniqlanishiga sabab bo’ldi, bular xarakterli strukturaga ega, ya’ni noyob DNK-speyserlarining qisqa uchastkalari bir-biridan qisqa palindrom takrorlar bilan ajralgan. Aynan ushbuAynan ushbuxususiyatiga ko’ra ular CRISPR deb nomlandi. Bundan tashqari bu kabi CRISPR kassetalari bevosita oqsil mahsulotlari nukleaza va xelikaza faolligiga ega bo’lgan Cas genlari (CRISPR-associated - CRISPR bilan assotsiatsiyalangan) yaqinida joylashgan bo’ladi. 1 Bir-biridan bexabar bioinformatiklarning uch guruhi speyser DNK ko’plab fag va plazmidalarning DNKsiga gomolog ekanligini 2005 yilda ma’lum qildi. 2007 yilda CRISPR speyser lokusida mavjud va bakteriofagga chidamli bo’lib borayotgan Streptococcus thermophilus hujayralari bakteriofagning genom DNKsiga komplementar ekanligi aniqlandi. Shu tarzda CRISPR/Cas texnologiyasi noyob mexanizm bo’lib mikroorganizmlarni begona DNK kirishidan himoyalashi va restriktsiya-modifikatsiya tizimi bilan bir qatorda faol bo’lib genetik ma’lumotlarni gorizontal ko’chirilishini cheklashi aniqlandi.
CRISPR - tizimlari prokariot organizmlar o’rtasida keng tarqalgan: ular 87% arxey va 48% eubakteriyalarda aniqlangan. SHuning uchun har xil organizm turlarida genomdagi (1-18) CRISPR-kassetalari miqdori kabi takrorlarning miqdori (o’rtacha 60) va xajmi (o’rtacha 23-37 n.j.), shuningdek speyserlarning soni va hajmi (17-84 n.j.) o’zgaruvchan bo’ladi. Bunda bir kasseta ichidagi speyserlar va takrorlarning uzunligi o’zgarmas va takrorlar ketma-ketligi esa bir xil bo’ladi.2
Himoya mexanizmi uch asosiy bosqichdan iboratdir. Birinchi adaptatsiya bosqichida bakteriya hujayrasiga kirgan begona DNKning kichik fragmenti yangi speyser hosil qilib xo’jayin genomining CRISPR-lokusiga o’rnatiladi. Virus genomida bu fragment protospeyser sifatida speyserga komplementar va qisqa flankirlangan konservativ izchillikda mavjud bo’ladi, bu PAM (Protospacer Adjacent Motif; protospeyserga tegishli motiv) deb nomlanadi. Yangi speyser doim CRISPR kassetasi oldidan AT ga AT ga boy lider ketma-ketlik tarafidan o’rnashadi, xuddi shu joyda promotorelementlari va regulyator oqsillarning o’tkazish saytlari joylashgan. Barcha izlanishlarga ko’ra, aynan shu tarzda ko’pchilik CRISPR/Cas-tizimlarining nishonlari hosil bo’ladi.
Transkriptsiyaning ikkinchi bosqichida barcha CRISPR lokuslari precrRNA (poly-spacer precursor crRNA; CRISPR RNKning yarim speyserli o’tmishdoshi) uzunligida transkriptsiyalanadi. Yetilmagan transkripning yetilgan crRNA holatiga protsessing qilinishi CRISPR/Castizimlarida ko’p hollarda Cas6 endonukleazalari tomonidan amalga oshiriladi. 39-45 nukleotid uzunligidagi qisqa crRNA (CRISPR RNK) bir speyser ketma-ketligiga ega bo’lib oxirlarida sterjen-bigiz strukturasining shakllanishida ishtirok etuvchi takrorlar joylashgan: gidroksil guruhiga ega takrorning so’nggi sakkiz nukleotidlari 5’ uchida sterjen hosil qiladi, va to’g’nog’ichsimon struktura 2’, 3’-tsiklik fosfat bilan 3’-uchida ilmoqli urchuq (bigiz)ni hosil qiladi. Uchinchi bosqich - begona RNK yoki DNKni interferentsiya (faoliyatini susaytirish) qilish, bu jarayon crrnA va cas-oqsillari kompleksining o’zaro ta’siri hisobiga amalga oshiriladi. CrrnA komplementar holda protospeyserning ketma-ketligini tanib oladi va cas-oqsillari ularning buzilishini ta’minlaydi.
DNK-nishonlarni effektor majmuasi bilan degradatsiya qilish uchun crrnA nukleotidlarining DNK-nishonlari bilan o’zaro -2, -3, -4 pozitsiyalarda (agar +1 protospeyserning birinchi asosiga qabul qilinsa) komplementar birikishi ro’y bermasligi kerak. CrrnA va DNK-nishonlarning o’zaro komplementar birikishi ushbu pozitsiyalarda effektor majmuasining shakllanishini buzadi, bu esa genom DNKsini qirqishga va uning keyinchalikdegradatsiyaga uchrashiga to'sqinlik qiladi. Viruslar va ularning xo’jayin organizmlarining uzoq koevolyutsiyasi viruslarda crISPr-interferentsiyalarga qarshi himoya mexanizmlarining paydo bo’lishiga olib keldi. Bu bakteriya va arxeylarda crISPr/cas-tizimlarining katta xilma-xilliklarga ega ekanligi bilan tushuntiriladi. Bioinformatik tadqiqotlar barcha crISPr/cas-tizimlarini asosiy uch tipga (I-III) va bu tiplarni yana kamida 10 ta guruhlarga bo’ladi. Hozirgi kunda bulardan S. Pyogenes patogenidan ajratib olingan II-A tipining crISPr/cas-tizimi genom muxandisligida faol qo’llaniladi. Bu bakteriyada cas genining minimal to’plami aniqlangan. Birgina polufunktsional cas9 oqsili pre-crrnA protsessingini hamda begona DNKning interferentsiyasini amalga oshiradi.
CrrnA protsessingi kodirlamaydigan kichik RNK - tracrrnA (transactivating crrnA; transaktiviruyuщaya crRNK) bilan ham bog’liq bo’ladi. TracrrnA molekulalari pre-crrnA ketma-ketliklarining takrorlari bilan dupleks hosil qilib komplementar bog’lanadi, xo’jayin hujayralarning ribonukleazalaridan biri - RNKaza III, cas9 ishtirokida 5’ uchida 20- nukleotidli speyser ketma-ketligiga ega bo’lgan yetuk crrnA ning hosil bo’lishi bilan dupleksni qirqadi. Butun lokusga Mg2+ ionlari ishtirokida cas9 ikki zanjirli ajralish kiritadi, bunda bu fermentning HnH nukleaza domeni crRNA ga komplementar DNK ipini qirqadi va RuvC - domeni nokomplementar ipni qirqadi. Cas9 S. pyogenes uchun DNK-nishon o’zida bevosita qirqish amalga oshiriladigan uch nukleotiddan so’ng 5’-nGG-3’ RAMni tutmog’i lozim. II tipining Cas9 uchun S. thermophilus va Neisseria meningitidis nishonlari mos ravishda boshqa konsensusga ega - 5’-nGGnG-3’ va 5’-nnnnGAtt- 3’. Genom muxandisligining umumiy strategiyasi sayt-spetsifik nukleazalar yordamida to’rt asosiy bosqichdan iborat:

1. 
   Genomda maqsadli nukleotid ketma-ketligini tanlab olish.
   
2. 
   Tanlab olingan nishonga yo’naltirilgan nukleaza konstruktsiyasini yaratish.
   
3. 
   Ushbu konstruktsiyani hujayra yadrosiga kiritish.
   
4. 
   Olingan mutatsiyalarning tahlili.
   

TALEN va CRISPR/Cas9 texnologiyalari yordamida ishlaganda ikki zanjirli bo’linmalarni spetsifik kiritish uchun saytlarni sinchkovlik bilan tanlab olish zarur. Dastlabki bioinformatik tahlillarga ko’ra, genomga ikki zanjirli bo’linmalarni kiritish maqsadsiz effektlarning ham ehtimolligi borligi bilan tushuntiriladi.1 Kerakli saytlarni tanlashda ketma-ketliklarning takrorlanishidan va genomning boshqa rayonidagi yuqori gomologiyalaridan qochish talab etiladi. TALEN ximerik oqsillari tizimidan foydalanilganda bir necha sabablarga ko’ra maqsadsiz effektlari vujudga keladi. Birinchidan, bu spetsifik nukleotidlar va RVD bog’lanishning effektivligidagi farqlardir. NN va HD monomerlari nukleotidlar bilan kuchli vodorod bog’lar hosil qiladi, bu vaqtda NG va NI - kuchsiz shakllanadi. Bu DNKtaniydigan domenlarni maqsadli saytlardan bir necha nukleotidlarga farqlanuvchi saytlar bilan bog’lanishiga imkon berishi mumkin. Ikkinchidan, kodning tug’ma bo’lgani uchun monomerlarning nukleotidlar bilan bog’lanish ehtimolligi mavjud, masalan, NG va A laming o’zaro bog’lanishi. Uchinchidan, ikki nukleazalarning FokI domenlari bir hil DNKga bog’lanuvchi domenlari (gomodimerlarning hosil bo’lishi) bilan dimerizatsiyaga uchrashi mumkin. Bu muammo majburiy geterodimerlar sifatida ishlovchi FokI domenlariga ega TALEN tizimini yaratish orqali bir qator ishlarni amalga oshirish davomida hal etilgan. Ehtimolli maqsadsiz effektlar nukleazalar tanish saytlari orasidagi speyser DNKning xajmi qayd etilmaganligi natijasida sodir bo’lishi mumkin. Bu xususiyat FokI domenlari dimerizatsiyalanishi uchun yetarli masofada joylashgan nukleazalarning maqsadsiz saytlar bilanbog’lanishida ikki zanjirli bo’shliq kiritish imkonini beradi. S. pyogenes cas9 nukleazalari 5’-NGG-3’ konsensusi bilan RAM larning majburiy ishtirokini talab etadi, bunda kam miqdorda bo’lsa ham u nishonlarni tanlashni cheklaydi. Xususan, odam genomida maqsadli (nishon) saytlar har 8-12 n.j. laridan so’ng joylashgan bo’ladi. CRISPR/cas9 tizimining asosiy kamchiligi - maqsadsiz mutatsiyalar paydo bo’lishining nisbatan yuqori ehtimolligidadir. In vitro, bakteriyalarda va odam hujayralarida olib borilgan tajribalarda 20 nukleotidli sgRNA (single guide RNA) larning speyser uchastkalarida ba’zi bir nukleotid almashinuvlari CRISPR/cas9 tizimining sezilarli darajada faolligini susaytirishga olib kelishi ma’lum qilingan, ayniqsa agar bu almashinuvlar sgRNA ning so’nggi 10-12 nukleotidlari 3’- oxirlarida joylashgan bo’lsa. Shu bilan bir vaqtda sgRNA ning 5’-oxiridagi almashinuvlar tizimning faoliyati uchun hech qanday ta’sir o’tkazmaydi. Ammo ma’lumki, agar sgRNA ning 3’-oxiridagi bir yoki ikki nukleotidli almashinuvlar CRISPR/cas9 tizimining faoliyatiga ta’sir etmaydi, va aksincha, agar 5’-oxirida joylashgan bo’lsa faoliyatga to’sqinlik qiladi. Umuman olganda, maqsadsiz effekt cas9 uchun 5’-oxiri nukleotidlariga nisbatan kam ahamiyatga ega ketmaketlikni yo’naltiruvchi 3’-oxiridagi -8-12 n.j. almashinuvlarning joylashishlari bo’yicha aniqlanadi, bunda Cas9 i sgRNA larga kiritiladigan almashinuvlar va aynan nishon-sayt xususiyatlarining kontsentratsiyasi va miqdori uchdan oshmasligi lozim. Ko’rsatilgan kamchiliklarni yengish cas9 ortologlarini qo’llashga asoslangan usullarni qidirish va ishlab chiqishga imkon beradi. Bularning faolligini ta’minlash uchun murakkab konsensus ketma-ketlikka ega RAM zarur hisoblanadi. Masalan, II tip N. Meningitidis CRISPR/cas PAM larni 5’-NNNNGATT-3’, konsensusi bilan taniydi, bu jarayonda nishon tanlash imkoniyatini cheklab spetsifiklikni oshirishi mumkin. CRISPR/cas tizimlari yordamida genomni tahrirlash spetsifikligini oshirish maqsadida sgRNA jufligi (ZFN va TALEN juftlik anologlari singari) bilan ikki Cas9 nikazalaridan foydalaniladi. Ushbu sgRNA jufligi FokI domenlari bilan faqat ikki mustaqil oqsillarning ta’siriasnosida DNKga bo’shliq (parchalash) kiritadi.1 Bir katalitik faol domenlarning mutatsiyasi (HNHda D10A va RuvCda H840A) Cas9 nukleazasini DNK-nikazaga aylantiradi. Agar DNKning ikkala zanjirini Cas9 nikaza juftligi bilan qirqilsa sayt spetsifik ikki zanjirli bo’shliqlar hosil qilishga olib keladi, bu bo’shliqlar DNK uchlarining (oxirlari) nogomologik (NHEJ - non-homologous end joining) tikilishi yordamida qayta juftlashadi, bunda alohida bo’lgan bir zanjirli parchalanishlar yuqori ekstsiziya (BERbase excision repair) asosida samarali ravishda qayta juftlashadi. Ikki Cas9 nikazalarini sgRNA juftligi bilan qo’llash maqsadsiz mutatsiyalarning hosil bo’lishini sezilarli darajada kamaytirishi va bu jarayonda maqsadsiz mutatsiyalarning chiqishi butunlay nukleazalarning qo’llanilishiga bog’liqligi ko’rsatib berilgan.
Keltirilgan CRISPR/ Cas9 va TALEN tizimlari yordamida maqsadli (nishonli) saytlarni tanib olish imkoniyatlari shu kabi saytlarni qidirishda qo’llash uchun kompyuter algoritmlarini tuzishda e’tiborga olingan. Hozirda turli kompaniyalar tomonidan yaratilgan onlayn dasturlash ta’minotlari mavjud bo’lib, ular CRISPR/ Cas9 va TALEN tizimlarining potentsial saytlarini tanlash, hamda ehtimolli maqsadsiz effektlarni aniqlash uchun ham mo’ljallangan. DNKga bog’lanuvchi domen deyarli bir xil takrorlardan tashkil topgan, shuning uchun TALEN ni ekspressiya qiluvchi genetik konstruktsiya tuzishda texnik xarakterga ega muammolarni hal etish talab etiladi. Bu borada 20-30 va undan ortiq monomerlardan iborat TALE DNKga bog’lanuvchi domenlarini yaratish imkonini beruvchi bir qator usullar taklif etilgan. Ushba strategiyalardan biri DNKni II tipli restriktsiya endonukleazalari va ligirlash-REAL (REstriction and Ligation) bilan gidrolizlash orqali DNKni standart klonlashtirishga asoslangan. Bunda birinchi bosqichda 5’ - va 3’ - oxirlaridan (uchlari) restriktsiya endonukleazasaytlari kiritilgan monomerlar kutubxonasi tayyorlanadi. DNK gidrolizidan so’ng juftlikdagi lgirlash jarayonlari o’tkaziladi va buning natijasida dimerlar (N1N2, N3N4, N2k-1N2k) hosil bo’ladi, bular keyinchalik tetramerlarga birlashadi. Bunda to’g’ri ketma-ketlikka turli restriktsiya endonukleazalarini qo’llash orqali erishiladi. Bu usul murakkab va uzoq vaqt talab etadi, har bir bosqichda reaktsiya mahsulotlarini tozalash hamda yo’nalishning to’g’riligini tasdiqlab borish ham talab etiladi. Bu jarayonlarni tezlashtirish maqsadida mono-, di-, tri - va tetramerlarni o’z ichiga olgan 376 elementlardan iborat kutubxona yaratilgan. Effektivlikni oshirish va yig’ish jarayonlarini tezlashtirish maqsadida Golden Gate reaktsiyasi qo’llaniladi, bu bir reaktsiya aralashmasida bir vaqtning o’zida ligirlash va restriktsiya endonukleazalari yordamidagidrolizlash imkonini beradi. Invitro sharoitlarda va bakteriya hujayralarida CRISPR/ Cas9 yordamida
DNKni qirqish uchun quyidagi komponentlar talab etiladi va yetarli hisoblanadi: kodirlamaydigan RNK tracrRNA va pre-crRNA, RNKaza III va Cas9 oqsili. Ushbu tizimni sut emizuvchilar hujayralarida qo’llash bir qator afzalliklarni beradi.
Birinchidan, SpCase9 (Cas9 S. pyogenes) nukleazasi kodonlar tomonidan optimallashtirilgan yuqori eukariotlar hujayrasidagi transkriptsiya jarayoniga moslashishi zarur hamda yadro kompartmentalizatsiyasini ta’minlash uchun yadro lokalizatsiyasi signallarini birlashtirish lozim (NLS - nuclear localization signal). Ikki NLS Cas9 ni yadroga samarali (effektiv) yo’naltirish uchun yetarlidir.
Ikkinchidan, eukariot hujayralarda pre-crRNA larni tayyor bo’lishi uchun ekzogen RNKaza III kiritilishi talab etilmaydi, chunki bu vazifani o’z hujayra RNKazalari samarali amalga oshiradi.
Uchinchidan, kodirlamaydigan ikki RNK o’rniga ko’pincha yagona ximerik sgRNA kiritiladi, bunda sintetik struktura “bigiz-asos” yordamida tabiiy crRNA- tracrRNA duplekslarni o’rnini bosish maqsadida yetuk crRNA tracrRNA qismi bilan birlashgan bo’ladi. sgRNA transkriptsiyasi uchun mos keluvchi promotor talab etiladi, masalan RNK-polimeraza III aloqador U6-promotori. Feng Zang (Feng Zhang) laboratoriyasida dastlabki plazmida konstruktsiyalari yaratilgan bo’lib bu konstruktsiya CRISPR/Cas9 ishlashi uchun talab etiladigan elementlaridan tashkil topgan. PX260/pX334 plazmidalari tarkibida uch ekspressiyalovchi kassetalar mavjud bo’lib bular; Cas9- nukleaza/nikaza, CRISPR RNK-matritsasi va tracrRNK. Nishon - ketmaketligini o’zgartirish uchun bu konstruktsiyadan faqatgina dastlabki 30- nukleotidli yo’naltiruvchi izchillikni kesib olish talab etiladi. Bu izchilliklar BbsI flankirlangan saytlar hisoblanib, uni sun’iy sintez qilingan izchilliklar bilan almashtiriladi. Ushbu jarayonni amalga oshirish uchun maqsadli ketma-ketlikka komplementar va mos ravishda yopishqoq uchlarni o’zida tutgan 30-a’zoli oligonukleotidlar birga erib va plazmidaga ligirlanadi.
PX330/pX335 plazmidalari ikki ekspressiyalovchi kassetalarni o’zida tutadi: Cas9-nukleaza/nikaza, 85-nukleotidli tracrRNK ni o’z ichiga olgan ximerik sgRNA. Yo’naltiruvchi ketma-ketlikni almashtirish prinsipi o’zgarmagan, lekin uning uzunligi qisqa - 20 nukleotid, bunda 20-m guanin bo’lishi kerak, hamda u6- promotor bu asosni transkriptsiya boshlanish nuqtasida ushlaydi. Bundan tashqari bu plazmidalarga 2A-GFP yoki 2A-Purosaytlari kabi qo'shimcha elementlar kiritilishi mumkin, bularning vazifasi - plazmidalarni o’zida tutgan hujayralarni keyinchalik selektsiya qilishdan iborat. Odam, sichqon va boshqa organizmlar hujayra kulturalarining transformatsiyasi uchun ko’pincha plazmidalardan foydalaniladi, bu plazmidalar cas9 va in vitro sgRNK nukleazalarning ishlab chiqarilishini ta’minlaydi. Butun organizm transformatsiyasi uchun Sas9 mRNK lariga va bir hujayrali embrionlarning sgRNK lariga mikroin’ektsiya maxsus usullari ishlab chiqilgan. Bu usul sichqon, danio (Danio rerio) va drozofilalarda faol qo’llaniladi. Keng qamrovdagi gen nokauti uchun sgRNKlarning katta kutubxonalaridan foydalanib lentivirus vektorlar qo’llaniladi. Hujayralari zich hujayra devoriga ega o’simliklarda protoplastlarning plazmida transformatsiya usuli hamda Agrobacterium tumefacients yordamidagi agroinfiltratsiya usuli qo’llaniladi.