I- Oksidatif patlamaya yönelik I- Oksidatif patlamaya yönelik
səhifə 11/11 tarix 01.04.2017 ölçüsü 446 b. #13067
I- Oksidatif patlamaya yönelik Nötrofillerin fonksiyonun değerlendirilmesinde En sık uygulanan test Süperoksit sentez yeteneğinin değerlendirilmesidir Kronik granülomatöz hastalığın taramasında Bu değerlendirme kullanılır ÇÜNKÜ; Bu hastalık fagositoz defekti sonucu gelişir ♣ Nötrofil içinde NADPH’ı (nikotin amid adenin di nükleotid fosfat de hidro genaz) etkileyen oksidaz enzimdeki bozukluktur Dört test yöntemi kullanılır Dört test yöntemi kullanılır 1)NBT (Nitroblue tetrazolium test) Testin prensibi NBT’ in redüksiyonuna dayanan bir testtir Redükte olduğunda sarı renkten koyu mora dönüşür Nötrofiller; NBT içinde 37 ºC’ de 15 dakika tutulur NBT, nötrofil içine alınır Pyridine ile ekstrakte edilir 515 nm dalga boyunda spektrofotometrede okunur Veya mikroskopta boyanarak görülebilir Testin değerlendirilmesi Nötrofiller içinde süperoksit ve H2O2 oluşur Bunların redüktan etkisiyle NBT redükte olur (renk değişir) Öldürme işlemi olduğunu gösterir Lökositlerin mikroorganizmaları öldürme işlemi bozuk olan hastalıklarda Kronik granülamatöz hastalık Chediak- Higashi sendromu Myeloperoksidaz yetmezliği olanlar Glukoz- 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği olanlarda Akut lösemi Down sendromu Akut enfeksiyonu olanlarda 2)Sitokrom b ölçülmesi 2)Sitokrom b ölçülmesi ■ Fagositlerde bulunan; Oksidaz enziminin parçası olan sitokrom –b’ nin İmmunolojik cihazlar Ve biokimyasal yöntemlerle ölçülmesidir 3) Flowsitometrik , DCF (dichlorofluoresan) yöntemi ■ Bu test H2O2 oluşumunu ölçer ■ Kronik granülomatoz hastalığın tanısında kesin sonuç verir 4)Kemülimunisans’a Dayalı immuno hematolojik cihazlar ■ H2O2, O-, O2 radikallerini ölçmeye dayanır Degranülasyon Degranülasyon Fagozom ve lizozomların füzyonu sonucunda Fagolizozomun içine lizozom içeriğinin boşalmasıdır ELISA yöntemiyle Lizozom içeriğinin Asid hidroloz Lizozim Laktoferrin Katyonik proteinlerin ölçümü yapılır Mikrobisidal test Mikrobisidal test Hasta ve kontrol grubundan nötrofiller alınır Hastalardan izole edilen bakteri ve mantar ile kültürü yapılır Bir gece beklenir Ertesi gün yaşayan bakteri veya mantar yoksa mikrobik öldürme tamdır DERİ TESTLERİ; DERİ TESTLERİ; Hücresel bağışık yanıtın değerlendirmesini Belirli bir patojeni veya temas antijenini tanıyan bellekli T lenf varlığını saptar Test pozitifliği ancak klinik öyküyle anlamlıdır En sık uygulanan model İntraselüler bakteri enfeksiyonlarında Tüberkülin deri testi olarak Old tüberkülin(OT) 1890 yılında R.Koch buldu PPD( purified protein derivide) uygulanır Saybert ve Glen 1941 yılında tanımladılar PPD-s olarak standardize edildi 1-TÜ : 0.00002 mgr PPD-s içerir M.tuberculosis enfeksiyonlarının tanısında kullanılır AYRICA; AYRICA; Blastomisin (blastomikoz) Histoplazmin (histoplazmoz) Brucellin (bruselloz) Frei testi (LGV) Toksoplazmin (toksoplazmoz) Ekinokokkin(ekinokokkoz) Deri testleride kullanılır Bunların dışında; Kontak duyarlılığında ilaç, metal, bitkisel maddelere karşı Dermatit tanısında panel antijenler kullanılır Prausnitz-Küstner (PK) reaksiyonu Atopik allerjili bir serum ve spesifik antijenin Diğer bir kişinin deri içine verilmesiyle ♣ Anafilaksinin pasif transferi gösterilir PPD; PPD; Montoux deri içi uygulaması ile yapılır 5 T U (0.1ml) ön kol iç yüzeyinin deri içine 48 -72 saat sonra endurasyon değerlendirilir Endurasyonu (Sertliği); ≥10 mm olan, ♣ BCG olmamış çocuk ve yetişkinlerde ♣ Pozitifliği gösterir ≥ 15 mm olan ♣ BCG’li çocuklarda pozitifliği gösterir 5-10 mm arası ♣ BCG aşılanmasına ♣ Atipiklerle çapraz reaksiyona ♣ Anerjiye bağlı olarak görülür Pozitif deri testinin anlamlı olması için; Klinik belirtilerden önce negatif daha sonra pozitif olması gerekir Deri testinde teknik hatalar ■ Uygunsuz antijen konsantrasyonu ■ Enjeksiyonun cildin derinine yapılması ■ Subjektif değerlendirme ■ Test yerine dışsal müdahaleler ■ Booster olayı gelişebilir Yaşla BCG aşılaması M.tuberculosis ve atipiklere karşı oluşan aşırı duyarlılık Booster’ı artırır İMMUN SİSTEMİN İMMUN SİSTEMİN Bileşeni ve hücrelerin doğal ya da özgül fazlarındaki Naif yapılarını Mutasyonel değişikliklerin Molekülleri genetik yöntemlerle ortaya koyan testlerdir. ÖRNEĞİN; Antijen sunan hücrelerde(ASH) MHC I ve II moleküllerinin tayini Ig’lerin Fab kısmında variable(v)bölgesini,Fc kısmındaki CH2 gibi aktif bölgelerin genetik yapıtaşlarının belirlenmesi Fagositlerin sentezinde enzim ve sitokinlerin genetik mutasyonlarını ortaya koyan testler Primer veya sekonder immün yetersizliklerin genetik mutasyonlarının ortaya konulmasında Nükleik asit teknolojisine (NAT ) dayalı test yöntemleri Nükleik asit teknolojisine (NAT ) dayalı test yöntemleri Klinik immunoloji laboratuvarında tanısal amaçlı daha yenidirler Rutin tanı amaçlı konvansiyonel yöntemlerin yerini ne kadar alacakları zamanla görülecektir ANCAK; ANCAK; Primer ya da seconder immun yetersizliğe bağlı birçok sendrom ve hastalığın, Örneğin X’e bağlı A-gammaglobulin hastalığı Artrit ve oto-immun hastalıklarla seyreder B hücre ve Ig izotiplerinde azalmaya nedeni olan B hücre tirozin kinaz genindeki mutasyonun belirlenmesi gibi Malign bazı hastalıkların; Örneğin;Hodgkin ve Non-Hodgkin lenfoma etiyolojisinde T lenfositlerinde moleküler bozulmaların tayini MOLEKÜLER TANISINDA SIKLIKLA KULLANILMAKTADIRLAR 1)Hibridizasyon (birleşme ) 2)Amplifikasyon (çoğaltma ) başlıkları altında incelenir Bir DNA molekülü Bir DNA molekülü Kompementerlik (birbirinin tamamlayıcısı) özelliğindedir Isı ya çeşitli kimyasal maddelerle ayrılabilen Uygun ısı, tuz konsantrasyonu , PH’da yeniden birleşebilen İki sarmal zincire sahiptir İşte tanı amacıyla nükleik asitlerin araştırılması Molekülün bu özelliklerine dayanmaktadır Klinik örnekte varsayılan etkenin nükleik asidi ısı ve kimyasal maddelerle iki zincire ayrılır Klinik örnekte varsayılan etkenin nükleik asidi ısı ve kimyasal maddelerle iki zincire ayrılır Bu zincirlerin varlığı PROB adı verilen işaretli DNA ve RNA parçasıyla gösterilmektedir PROB adı verilen reaktiflerin işaretlenmesinde Flurokrom Enzim Kemülüminesan madde Radyoizotop kullanılmaktadır PROBLAR Hedef nükleik asitlerin belirli bölgelerine komplementerdir 50 bp’den küçüktürler a)Sıvı faz hibridizasyonu Sıvı ortamda prob ve hedef nükleik asit serbesttir b)Katı faz hibridizasyonu I-MAKROARRAY( makroskobik dizinleme) yöntemi Nitro selüloz ve Naylon gibi porlu yüzeylerde yapılır Southern blot Southern blot DNA’lar; Agaroz jel elektroforezle, nitroselluloz ve naylon membran kağıda aktarılır Restriksiyon enzimleri ile klinik örnek temas ettirilir DNA/DNA (32p-Biotin/Avidin peroksidaz) Nokta mutasyonları, delesyonlar ve translokasyon sonucu farklılıkların saptanmasıyla hematolojik malignitelerin özelliklerinin belirlenmesinde kullanılır Burkitt lenfoma, Foliküler lenfoma Kronik myeloid lösemi AYRICA; AYRICA; B hücre lenfomalarında ♣ B hücre klonizitesinin incelenmesinde T hücre lenfomasında ♣ T hücre klonizitesinin incelenmesinde Nükleik asit boyutları konusunda yardımcı olur Northern blot Northern blot RNA’lar, Nitroseluloz kağıtlara aktarılır mRNA /cDNA-cRNA hibridlemesinde 32p-Biotin/AP işaretlemesi kullanılır Dot blot DNA’lar, Nitroselüloz kağıtlarda DNA/DNA 32 p-Biotin/AP işaretlemesi kullanılır II-MİKROARRAY II-MİKROARRAY Klinik örnekten Nükleik asidin pürifikasyonu Amplifikasyonu Hibridizasyonu Tespiti 25- 75 mm’lik slaytlarda yapılmaktadır Uygulama alanları Antimikrobiyal ilaç keşfi ve geliştirilmesi ile aşı çalışmaları Konak bağışıklık sistemindeki polimorfizmler Gen up ve downregülasyonları Apoptozis mekanizmalarında Kanserlerin sınıflandırması ve derecelendirmesinde Doku yada hücrelerdeki; Doku yada hücrelerdeki; Nükleik asitleri saptar DNA/DNA hibridlemesinde; Biotin/AP işaretlemesi kullanılır 16S/23S r-RNA’ları hedefleyen Fluorokrom’la işaretleme olur FISH (flouresan inn situ hibridizasyon yöntemi ) FISH yöntemiyle; FISH yöntemiyle; Kromosomal lokalizasyonunu haritalamak Veya kromozomal bozukluklarının saptanmasında kullanılır T hücre fonksiyonlarının belirlenmesinde NAA yöntemleri adı altında incelenmektedir İncelenecek örnekteki az sayıda hedef molekülün (DNA, RNA) İncelenecek örnekteki az sayıda hedef molekülün (DNA, RNA) İnvitro enzimatik replikasyon yöntemleriyle Saptanabilecek düzeylere çıkarılmasıdır PCR PCR Klinik örnekte DNA aranıyorsa 4 adet deoksinükleik trifosfat (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) Özgül oligonükleotik primerleri (15-30 bazlık) Isıya dayanıklı Tag polimeraz enzimi 94 ºC’de (denatürasyon) 54 ºC’de (bağlama) 72 ºC’de (Genişleme) ♣ Bu işlem 25-30 kez yapılır Southern hibridizasyonla tanımlama yapılır Klinik örnekte RNA aranıyorsa RNA’nın elde edilmesinden sonra Revers-Transkriptaz uygulanarak cDNA’ya çevrilir Daha sonra cDNA amplifiye edilir Değişik PCR tipleri Değişik PCR tipleri Arbitrarily primer PCR(APP) Multiplex PCR(MP) Nested PCR(NP) RT-PCR(RTP) Kantitatif PCR(KP) Real time PCR(RTİP) Eş zamanlı Eş zamanlı Nükleik asit amplifikasyonu Amplifikasyon sırasında saptama yapılır Floresan sinyalin ölçülmesi (Cyber green I) Kantitatif ve kalitatif sonuç Kısa sürede (2-3 saat) alınır DNA Bağlayıcı Flouroforlar DNA Bağlayıcı Flouroforlar Etidyum Bromid Syber Green Syber Gold Problar Lineer Oligo problar “HybProbes” 5’ Nükleaz Oligo problar “Taq Man” ** Molecular becon Hedef molekülleri RNA ’dır Hedef molekülleri RNA ’dır TAS( Transcription based Amp) TMA(Transcription mediated Amp) NASBA (Nükleik Asid Sequence based Amp) Northern blot ile tanımlama yapılır Klinik immunoloji ve moleküler biyoloji lab. Klinik immunoloji ve moleküler biyoloji lab. İnsan immun sistem bileşenleri genomu ve kanser genotipi incelemelerinde DNA yapısındaki mutasyonlar Gen tayini ve dizilimi saptaması Gen ve genetik polimorfizmi saptama Transkriptlerin özellikleri ve miktarı saptanması Genetik manipülasyonun saptanması B) Prob Hibridizasyon Bazlı (NAA) Yöntemi B) Prob Hibridizasyon Bazlı (NAA) Yöntemi Ligasyon yardımı ile prob çoğaltılmasına dayanır Hedef DNA + Prob Hibridizasyon / Ligaz C) Sinyal Amplifikasyon Bazlı NAA Yöntemi C) Sinyal Amplifikasyon Bazlı NAA Yöntemi Aslında prob hibridizasyon çoğaltma yöntemidir İki prob kullanılır Birinci prob hedef NA dizisini tanır Üzerinde ikinci probu bağlama bölgesi vardır Çok sayıda sinyal taşıyan 2. prob 1. proba bağlanır SONUÇTA HEDEF DİZİ +1 Prob/2. Prob hibridi oluşur Bağlama bölgesindeki bol miktardaki sinyalle HİBRİD oluşur RCA (Rolling Circle Amp) Tek nükleotid polymorfizm Allellik ayrımında kullanılır MHC ve ÜRÜNLERİ MHC ve ÜRÜNLERİ İnsan 6. kromozom kısa kolunda yer alırlar Üç gen bölgesine sahiptirler MHC Sınıf I gen bölgesi HLA-A,B,C,E,F,G antijenleri MHC Sınıf II gen bölgesi HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP antijenleri MHC Sınıf III gen bölgesi HLA molekülleri HLA molekülleri Glikoprotein yapısındadırlar Transmembranöz yapıda bulunurlar Yüksek polimorfizm (bireyden bireye) gösterirler HLA-I; En fazla lenfosit, lökosit olmak üzere Tüm çekirdekli somatik hücrelerin çoğunda, Eritrositler hariç HLA-II ise; Sınır olup APC (dendritik hücre, makrofaj) B lenfositleri, Aktive T4 lenfositleri, Endotel, böbrek glomerül hücrelerde bulunur Organ ve doku tipi nakillerinde, HLA uyumu Organ ve doku tipi nakillerinde, HLA uyumu Adli tıpta Babalık tayininde Kimlik tanımlamasında Bazı otoimmun hastalıkların tanısında HLA-DR4 ile RA HLA-B 5 ile Behçet hastalığı Üç grup altında yapılmaktadır Üç grup altında yapılmaktadır 1) MOLEKÜLER/DNA TEMELLİ YÖNTEMLER 2) Antikor Temelli Yöntemler 3) Hücre Temelli Yöntemler Özgün, esnek, yeni alleller yeni reaktiflerin geliştirilmesi, Özgün, esnek, yeni alleller yeni reaktiflerin geliştirilmesi, Canlı hücre gerektirmemesi, Otomasyona uygun olması(serolojik ve hücresel yöntemlere göre), Eşzamanlı çok sayıda örnek ile çalışma HLA genlerindeki tüm çeşitliliklerin gösterilmesi, serolojik olarak tanımlanamayan alllellerin gösterilmesi HİBRİDİZASYON YÖNTEMİ İLE; HİBRİDİZASYON YÖNTEMİ İLE; Sekansa spesifik oligonükleotid (SSO ) prob hibridizasyonu ile HLA-I ve II tayini AVANTAJLARI; Sekansa özgü oligonukleotitler kullanılarak yapılır Tüm lokusu içine alacak şekilde primer seçilir Strip, tüp, çip (mikroarray), boncuk (luminex teknoloji) Solid organ transp. da yeterli (böbrek, krc transp) Çok sayıda örnekle çalışılabilir PCR ile çoğaltılan HLA gen segmentinin PCR ile çoğaltılan HLA gen segmentinin SEKANS CİHAZINDA, nükleotid dizi analizi yapılmaktadır KULLANIM ALANLARI; Böbrek alıcısı gibi hızlı sonuç gerektiren örneklerde Denk olan vericilerin tespit edilebilmesi , diğer yöntemlerle elde edilen karmaşık sonuçların çözülmesi amacıyla sık kullanılmaktadır. SSCP (Single stranded conformational polymorphism)(PAGE)) SSCP (Single stranded conformational polymorphism)(PAGE)) Pyrosequencing Ekzonükleazla released fluorescence gibi Immunolojide son yıllarda önem kazanan Immunolojide son yıllarda önem kazanan Mikro RNA’lar(Mi RNA) Post transkripsiyon döneminin regülatör proteinleri olarak ortaya çıkan çeşitli kanserlerin ve hastalıkların tanısında kullanılan küçük RNA parçacıklarıdır. A)Mikro-RNA bazlı çalışmalar Mikro-RNA’nın direkt kantitatif tayinidir Mikro-RNA’nın klonlama tayinidir Mikro-RNA ekspresyon ölçümüdür B)Immunolojide bioinformatik gelişmeler Immun genomik sistemlerin moleküler genetik bazlı sayısal veri sunan analiz teknikleriyle bilgisayar ortamında ortaya konmasıdır Mikro array ve genom dizilimi Mikro array ve genom dizilimi Deep sequencing Quantatif Real Time -PCR Mikrodizi veri analizi Dostları ilə paylaş:
