2.2. Genlami rekombinant k-ONK lar orqali transformatsiya qilish
Yuqorida qayd ctilganidck, teskari transkriptaza fermenti yordamida fermentativ usulda ko‘pincha murakkab, yirik strukturaviy genlami sintezlash mumkin ekanligi ko‘rsatildi. Lekin k-DNKdagi strukturaviy genlar funksiyasining amalga oshishini ta’min etuvchi regulator genlami bu metod yordamida sun’iy sintezlash ancha qiyinchilik bilan amalga oshirilishligi ham ko‘rsatildi. Bayon etilgan sabablarga binoan gen injeneriyasida ko‘pincha transgenoz uchun qulay boigan obyekt boimish donor organizmdan ajratib olingan tabiiy genlar ishlatiladi.
Transgenozni bu metod yordamida amalga oshirish uchun molekular- genetik tadqiqotlar, tajribalar quyidagi to'rtta bosqichda amalga oshiriladi:
donor organizmdan genni ajratib olish; b) vektor-plazmidaning DNKsini halqasimon holatdan yoyilgan shaklga keltirish; d) rekombinant (duragay) k-DNK yaratish; e) rekombinant DNKning kerakli gen joylashgan qismini rcsipient organizm genomiga ulash va uning faoliyat ko‘rsatishi uchun zarur sharoitni hujayra ichida yaratish. Buning uchun quyidagi molekular- genetik tadqiqotlar amalga oshirildi.
Donor organizmning DNKsi restriktaza fermenti yordamida ko‘p boiaklarga boiinadi. Bu ferment DNK molekulasining muayyan joyini kesib, uni qismlarga boiadi. Restriktazaning xillari ko‘p boiib, ulaming har biri DNK molekulani «taniy oladigan» nukleotidlar tartibi joylashgan joyidangina uni kesadi. Ba’zi bir restriktaza EcoRl deb belgilangan xillari DNKdan GAATT yoki TTAAG nukleotidlari tarkibidagi adenin va guanin joylashgan joyining orasidan kesadi. Shuning bilan birga bu ferment kesib tayyorlagan DNK qismlari uchlarida bir-biriga komplementar boigan A A yoki TT nukleotidlari joylashgan boiadi. DNK boiagining bunday uchlari yopishqoq uchlar deb nomlanadi. Chunki DNK boiaklari ushbu uchi bilan vektoming va u orqali retsipient organizm DNKsiga ulanadi (ilova - 82-rasm).
Vektor-plazmidaning halqasimon DNKsi restriktaza fermenti yordamida bir joyidan uzilib, chiziqli uzunchoq yoyilgan shaklga keltiriladi.
Rekombinant (duragay) DNK molekulalarini yaratish uchun donor- dan retsipientga ko‘chirilishi kerak boigan gen joylashgan va joylashmagan DNKning boiaklari plazmida DNKsiga ulanib, duragay (rekombinant) DNK hosil qilinadi. Buning uchun donoming maydalangan DNKsi joylashgan eritmaga uzunchoq holatga keltirilgan plazmida DNKsi hamda
DNK boiaklarini bir-biriga ulaydigan ligaza fermenti solinadi. Bu fermentning yordamida donoming DNK boiaklari bittadan vektor-plazmida DNKsiga ulanadi. Keyingi bosqichda plazmida DNK sining uchlari ulanib, ulami yana halqasimon holatga keltiriladi. Shuni ham ta’kidlash kerakki, duragay DNKlaming ichida: a) haqiqiy rekombinantlari, ya’ni donordan retsipientga ko‘chirish ko'zda tutilgan genga ega boiganlari; b) bu genga ega bo‘lmaganlari mavjud boiadi.
Transgenozning yakuniy qismi o‘zida donoming muayyan geniga ega boigan vektoming rekombinant (duragay) DNKsini retsipient organizmga kiritish va uning DNKsiga ko‘chirilayotgan genni ulash va uning o‘z funksiyasini normal bajarishini ta’min etishdan iborat. Buning uchun: a) duragay DNKga ega boigan vektor - viruslar retsipient bakteriyalari tanasiga kiritiladi;
retsipient bakteriyalar tanlab, ajratish muhiti sharoitida o‘stiriladi. Selektiv muhit retsipient bakteriyalaming o‘sishi uchun maxsus tayyorlangan oziqa modda boiib, unga ushbu bakteriya shtammi chidamsiz boigan antibiotik yoki pestisid qo‘shiladi. Eslatib o‘tamiz, donor bakteriya ushbu antibiotik yoki pestisidlarga chidamlilik geniga ega;
selektiv muhit sharoitida genomiga retsipicntning chidamlilik geni donoming DNKsiga ulangan boisa, u bakteriyalar nobud boimaydilar, yashab ko‘payishlari mumkin. Demak, uning genomiga vektor - plazmidaning haqiqiy rekombinant DNKdagi retsipientning muayyan antibiotik yoki pestisidga chidamlilik geni o‘tgan. Qolgan bakteriyalar, jumladan, donoming bayon etilgan geni yo‘q DNK qismlari bilan olingan duragay DNK o‘tgan bakteriyalaming hammasi nobud boiib ketadi;
nobud boimay yashab qolgan bakteriyalami ko‘paytirish jarayonida rekombinant DNK molekulasi va undagi transgenoz qilingan gen ko‘paytiriladi. Chunki ularda replikatsiya namoyon boiadi. Shunday yoi bilan bu molekulalar klonlashtiriladi (ko‘paytiriladi). Yuqorida bayon etilgan transgenoz natijasida muayyan antibiotikka yoki pestisidga chidamlilik geni donor bakteriyalardan retsipient bakteriyaga rekombinant DNK molekulalari orqali o‘tkazildi, ya’ni transformatsiya qilindi. Natijada retsipient bakteriya ham donorga o‘xshash muayyan antibiotik yoki pestisidga chidamlilik xususiyatiga ega boiadi.
Rekombinant k-DNK yaratish va uni klonlashtirish va undagi donor genni vektor orqali retsipient organizmga transgenoz qilish sohasida gen injeneriyasi qator yutuqlarga crishdi (ilova - 83-rasm). Buning tasdig‘i sifatida gen injencriyasining odamlarda ko‘p tarqalgan diabet kasalini davolovchi insulin dorisini gen injeneriyasi metodi yordamida sintez qilish yo‘lga qo'yilganligini keltirish mumkin.
Endi odamdagi insulin moddasini sintezlovchi genni prokariot organizm boigan ichak tayoqchasi bakteriyasi
E.coli ga o‘tkazib, transgenoz qilish metodi bilan mukammal tanishamiz. Bu jarayon quyidagi to‘rtta bosqich orqali amalga oshiriladi (ilova - 84-rasm):
Odam insulinini sintezlovchi genni organizmdan ajratib olish. Ushbu bosqich prokariotlamikiga nisbatan anchagina murakkab metodlar orqali amalga oshiriladi. Buning uchun quyidagi metodlardan muayyan tartibda foydalaniladi: 1) Birinchi metod uch bosqichda amalga oshiriladi:
insulin oqsilini sintezlovchi organ boimish oshqozon osti bezida sintezlangan i-RNK molekulasidan mumkin qadar ko‘proq ajratib olinadi;
teskari skriptaza fermenti yordamida bu i-RNK andozasi negizida komplementar DNK, ya’ni k-DNK sintezlanadi. k-DNK donor organizmi DNKsidagi genlarining i-RNK kodlangan qismini o‘zida kodlagan boiadi;
k-DNK restriktaza fermenti ta’sirida ko‘p qismlarga boiinadi. Eritmada shunday holatga keltirilgan k-DNK plazmida - vektorlar DNKsi bilan integrasiya qilinishga tayyor hisoblanadi.
Vektorlik vazifasini bajaruvchi plazmidaning halqasimon shakldagi DNKsi restriktaza fermenti ta’sirida bir joyidan uzilib, uzunchoq holatga keltiriladi. Shunday DNKga ega boigan plazmida vektorlik vazifasini bajarishga tayyor hisoblanadi.
Rekombinant (duragay) DNKni yaratish. Buning uchun donor organizmning parchalangan k-DNKsi joylashgan eritmaga DNKsi uzunchoq holatga keltirilgan plazmidalar hamda k-DNKning parchalangan boiaklarini plazmida DNKlariga ulaydigan ligaza fermenti qo‘shiladi. Shunday sharoitda plazmidalar DNKsi rckombinatsiya jarayonida k-DNK parchalarini ligaza fermenti yordamida ulab, rekombinant (duragay) DNK molekulalari hosil qilinadi. Shunday holatda o‘zining DNKsida k-DNK parchalariga ega boigan plazmidalar hosil boiadi. Ulami ikkita guruhga boiish mumkin. Ulaming birinchi guruhi haqiqiy rekombinant k-DNKli plazmidalar. Ular DNKsiga transgenoz qilinishi kerak boigan gen joylangan k-DNK boiagi joylashgan boiadi. Ikkinchi guruhi qalbaki rekombinant DNKli viruslar. Ularda k-DNKning o‘sha gen joylashmagan boiagi ulangan boiadi. Haqiqiy (duragay) k-DNK vazifasini birinchi guruhga mansub plazmidalar bajaradi.
Rekombinant k-DNKning odam insulin oqsilini sintezlovchi geni joylashgan qismi ichak tayoqchasi bakteriyasi (E.coli) genotipiga o‘tkazilib ulanadi va uning faoliyati uchun zarur sharoit yaratiladi. Natijada E.coli ning transgenoz shtammi yaratiladi va u laboratoriya sharoitida odamga xos insulin oqsilini sintezlay boshlaydi (ilova - 85-rasm).
Gen injeneriyasi metodlarining jadal rivojlanishi natijasida ba’zi hayvonlar (sichqon, quyon) ning va odamning ko‘p oqsil genlarining hamda ribosoma va transport t-RNK genlarining klonlari olindi. Odamda gen injeneriyasini qoilash sohasidagi tadqiqotlar natijasida odamning insulin (diabetni davolaydi), o'sish gormoni (pakanalikni davolaydi), interferon (vims qo‘zg‘atadigan kasalliklarni davolaydi), sun’iy sintezlash yo‘li bilan odamlaming B - gepatit deb nomlangan sariq kasalliga qarshi ishlatiladigan vaksina genlarini klonlashtirib, odamning ichaklaridagi foydali ichak tayoqchasi bakteriyalari genotipiga o‘tkazildi va bu genlaming ekspressiyasi, ya’ni muayyan oqsilni laboratoriya sharoitida sintez qilishiga erishildi. Gen injeneriyasi metodi bilan olingan bu fiziologik faol dori preparatlardan insulin klinikada sinalib, tibbiyot sanoati darajasida ishlab chiqarish yoiga qo‘yildi. 0‘sish gormoni, interferon, B gepatitiga qarshi vaksina klinikada ishlatilmoqda. Odamning A va B deb ifodalangan gemofiliya kasali genlarining klonlashtirish bosqichi samarali amalga oshirildi.
Gen injeneriyasi madaniy o‘simliklar genetikasida ham qoilanilib, ulaming xo‘jalikda ahamiyatli belgilari
genlarini ajratib olib, klonlash orqali ulaming noyob genlari bankini yaratish bo‘yicha samarali tadqiqot olib borilmoqda. Gen injeneriyasi metodi bilan gerbisidlarga, zararli hasharotlarga, sho‘rxoklikka chidamli, yuqori hosil beruvchi 0‘simlik navlarini yaratish bo‘yicha tadqiqotlar rivojlantirilmoqda. Bu sohada amalga oshirilayotgan tadqiqotlaming mohiyati bilan 1984-yilda Amerika olimi Mari-Dell Chilton amalga oshirgan ilmiy ishlari natijasi misolida tanishamiz (ilova - 86-rasm). Uning tajribalarida tamaki o‘simligining gerbitsidga chidamlilik genini gerbitsidga chidamsiz navga transgenoz qilindi. Buning uchun Chilton tajribalari quyidagi molekular genetik jarayonlar orqali amalga oshirildi. Tajribadagi tamaki navining gerbitsidga chidamlilik genini ajratib olib, ichak tayoqchasi
(E.coli) bakteriyasi plazmidasiga joylab, uni klonlab ko‘paytirildi.
Agrobacterium tumefaciens bakteriyasi plazmidasi yordamida unga begona boigan gen ulaming hu- jayralariga o‘tkaziladi.