Mavzu: kirish. Mikrobiologiya fani va uning vazifasi

PRISIPATASIYA REKSIYАSIGA ASOSLANGAN USULLAR

1. “Tomchi” usul: qishloq xo’jaligida keng ko’lamda qo’llaniladigan ilk usullardan biri Dunin va Papova tomonidan yaratilgan AT tutuvchi va AG tutuvchi tomchilarni birbiriga aralashtirishga asoslangan va amaliyotda “Tomchi” usul deb nomlangan usulni ko’rsatish mumkin. Uni ishlatilganda o’simlikni tozalanmagan shirasining bir tomchisi antizardobning (AZ) bir tomchisi bilan aralashtiriladi. Bunda xloroplastlarga, hujayra devorining qisimlariga va mitoxondriyalarga va boshqa hujayra qisimlariga yopishgan virus zarralari buyum oynasiga tomizilgan bir tomchi AZ bilan ta’sirda bo’ladi, reaksmyaga kirishadi va ko’z ilg’aydigan presepitat hosil qiladi. Bu usulni sezgirligini tozalanmagan o’simlik shiralaridagi viruslarni aniqlaganda ancha pastdir, shuning uchun ham u o’simlik hujayralarida ko’p to’planadigan viruslarni aniqlashda ishlatiladi. Masalan: bunday viruslarga tamaki mozaikasi virusi (TMV), kartoshkaning X-virusli (KXV) kiradi. Ular hujayrada yuqori konsentrasiyada to’planadi, 1 kg shu viruslar bilan massalangan tamaki bargidan 1-3 gr tozza virus ajratish mumkin. Boshqa xil viruslar, masalan, kartoshkaning u-virusi (KUV) jo’xorining pakana mozaikalai viruslari (JPMV) esa hujayrada juda kam to’planadi. 1 kg o’simlik bargi materialidan 0.02-0.01 gr va undan ham kam virus ajratib olish mumkin.
“Tomchi” usulining takomillashtirilgan turi ham mavjud. Ularda halqa prisipatasiya usulini kuzatadigan bo’lsak, uni qo’llanilganda reaksiya buyum oynasi o’rniga probirkalarda olib boriladi. Probirkadagi virusga AZ qo’shilganda virus va AZ bir-biri bilan qo’shilgan zonada halqasimon prisipatat hosil bo’ladi. Bu usulda viruslarni aniqlash tez amalga oshadi ammo usulni sezgirligi ancha pastdir.
2.“Tomchi” usulining yana bir takomillashtirilgan turi-ammoniy sulfat (ASU) usulidair. Uning yuqoridagi turlardan farqi shundaki, reaksiyada ishtirok etadigan hujayra shirasi qisman ammoniy sulfati yordamida tozalanadi. O’simlik shirasiga 1.31 % ammoniy sulfati solinadi va 6000 aylanish tezligida 15 min davomida sentrifuga qilinadi. O’simlik to’qimasi va har xil oqsil agregatlari cho’kmaga tushadi va cho’kmaning ustidagi suyuqlik AZ bilan aralashtiriladi va 3 soat davomida inkukbasiya qilingandan so’ng reaksiya natijalari lupa yordamida 10-15 marta katta qilib ko’rib hisoblanadi. ASU kartoshkani kasallantiruvchi virusni aniqlashda yaxshi natija beradi.
3. “Tomchi” usulining keyingi mikro turlaridan biri mikroprisipatasiya reaksiyasidir. Bu usulda aniqlash amalga oshirilganda reaksiya gidrofob sathda amalga oshiriladi. Bug’lanishning oldini olish uchun esa reaksiya o’tkaziladigan buyum oynasi devorlariga parafin suriladi, aralashma 24 soat davomida inkubasiya qilingandan so’ng natija hisobga olinadi.
2. DIFFUZIYАGA ASOSLANGAN USULLAR
Immunodiffuziyaga asoslangan usullarning asosida agar-agar gelida virus (AG) va AT larning diffuziya natijasida bir-biri bilan uchrashib ko’zga ko’rinarli preparat hosil qilish yotadi. Bu usullar virus va AT ni diffuziyasini o’tishiga qarab 3 turli bo’ladi: radial immunodiffuziya (RID), ikki tomonlama immunodiffuziya (IID), va immunoelektroforez (IEF).
1. Radial immunodiffuziya (RID) usulida agar-agar gelida AZ solinib shimdiriladi va gelda tayyorlangan chuqurchaga virus (AG) qo’yiladi. Virus radial yo’nalishda tarqaladi (diffuziya buladi) va chuqurcha atrofida AS bilan uchrashib presipatat hosil qiladi. RID qulay va sezgir usullardan: Masalan, sharsimon viruslar agar-agar gelida oson diffuziya bo’ladi va chuqurcha atrofida ko’zga yaxshi ko’rinadigan halqasimon presipitat hosil qiladi. Ammo 0,75 - I % agar-agar gellari bo’shliqlarida yirik va ipsimon viruslarning diffuziyasi ancha qiyin bo’ladi. Diffuziyani yengillashtirish va maxsus presipitatning xosil bo’lishini tezlatish uchun virus zarrasini (AG ni) parchalab olinib reaksiyada ishlatiladi. Parchalash uchun odatda ba’zi kimyoviy moddalar - pridin, pirrolidon, formamid, mochevina, natriy dodesilsulfati xamda fizikaviy ta’sirlardan ultratovush, termodenaturasiya ishlatiladi. Virus oqsilining bu xildagi degradasiyasi ta’sirida virus tashqi qavatining oligomer oqsillari hosil bo’ladi va ularni D-oqsil deb ataladi. D-oqsili molekula massasi jihatidan virus molekulasidan bir necha barobar kichik bo’lganligi sababli agar-agar gelining teshiklari orasidan qarshiliksiz harakat qiladi va presipitasiya reaksiyalarida ishtirok etadi. Shuni xam aytish joizki, ba’zi hollarda D - oqsilining o’ziga xosligi virusning maxsus hususiyatidan birmuncha farq qiladi. Shu sabali denaturasiya bo’lgan virus presipitasiyada ishtirok etmasligi ham mumkin. Masalan, bunday xolatni denaturasiyalangan arpa shtrixli mozaikasi virusida (AShMV) kartoshkaning X-, S-, M- mozaikali viruslarida uchratish mumkin.
2) Ikkiyoqlama diffuziya reaksiyasidan (IID) foydalanilganda RID kabi AZ agar-agarga shimdirilmasdan hosil bulganpresipitat AG va AZ to’ldirilgan chuqurchalar orasida hosil bo’ladi. Bu ikki usul ba’zi jihatlaridan bir-biridan farq qilsa ham olingan natijalar IID-dagi bilan o’xshash buladi. RID ning sezgirligi IID nikiga qaraganda ancha yuqoridir. Masalan, bu holatni kartoshkani X-virusini aniqlashda yaxshi kuzatish mumkin, ya’ni RID usulida KXV ni I mkg/ml, IID da esa - 10 mkg/ml miqdorda aniqlash mumkin (1-jadval). RID va IID usullarining sezgirligini KXR ning D-oksidini aniqlashdagi holatini ko’radigan bo’lsak, bu sezgirlik quydagicha bo’ladi: MPR-0,5mkg/ml, RID - I mkg/ml va IID - 10 mkg/ml dir.
IID ning sezgirligi qator faktorlarga bog’likdir. Shulardan ma’lum o’rinni "virus - antitelo" birikmasi o’ynaydi. Chunki , 0,6 % li agar-agarda 0,1 % natriy dodesil sulfati va AShMV D - oqsilining AZ si ishtirokida AShMV ni 10-15 mkg/ml konsentrasiyasida aniqlash mumkin. Xuddi shunga o’xshash sharoitda sitrus o’simliklari viruslarini aniqlaganda ham sezgirlik darajasi 1-2 mkg/ml gacha boradi. Ko’rinishdan birinchi holatda ishlatilgan AZ ning titri past bo’lgan bo’lishi mumkin, ikkinchidan AG va AZ solingan chuqurchalarning o’lchovi va ular orasidagi masofa, detergent turi va konsentrasiyasi, natriy azidi va agar-agarning konsentrasiyasi va navi ma’lum o’rin egallashi mumkin.
RID va IID usullari yordamida ommaviy miqiyosida analizlar qilish imkoniyatlari tug’uladi. Masalan, 90 mm diametrli Petri kosachasida 500-600 namunani joylashtirish va analiz qilish mumkin.