Mavzu: kirish. Mikrobiologiya fani va uning vazifasi

4. NISHONLANGAN MODDALAR ISНLATISHGA ASOSLANGAN USULLAR
Yuqorida keltirilgan presipitasiya va aglyutinasiya reaksiyalariga asoslangan usullar aniqlanadigan virusning miqdori namunada ko’p bo’lishini talab etadi. Tabiiyki, imminoximik reaksiyasida qatnashadigshan ATN yoki AGN birorta modda (ferment, radioaktiv moddalar) bilan nishonlansa imminoximiya reaksiyasini o’tishini yaxshilanib usul sezgirligini bir necha martaga oshirish mumkin. Keyingi yillarda har xil nishonlarga asoslangan usullar rivojlanmoqda. Bulardan RIA, FIA, IFA va komplementar DNK zontga (dot-opot) aosolangan usullarni ko’rsatish mumkin.
1) Radioimmun analizi (RIA) usuli sezgirligi jihatidan eng mukammal immunologiya usullaridandir. Bu usulning mohiyati shundan iboratki, birorta virus ATS radioaktiv yod (1¹²⁵ yoki 1¹³¹) bilan nishonlanadi. Bu usulni fitovirusologiyada 1793 yilda Voll tomonidan qo’llanildi. Avval qattiq fazaga (polisteroldan qilingan chuqurchalar majmuasi) vvirus zarralarining AT lari immobilizasiya (poldisterolga bog’lanish) qilinadi va undan so’ng AG solinadi va ma’lum vaqtdan so’ng nishonlangan ATlar solinadi. Bu usulni ishlatib virus aniqlanganda sezgirlik 0.5 mkg/ml dan to nanogrammlargacha bo’lishi mumkin. Masalan, Gabrial - o’z zquvchilari bilan ushbu usulni qo’llab gulkaram m ozaikasi virusini 5 ng/mlgacha sezgirlik bilan aniqladi.
2) Flurossent zontlari yordamida virus aniqlash usullarida lyuminessent nishonni aniqlamoqchi bo’lgan virusni ATS tarkibiga kiritiladi. Jo’xori xlorozi virusini ATS ni flurossent zont bilan kimyoviy o’zgartirilib yuqori sezgirlikda aniqlanganligi bunga misol bo’lishi mumkin. Bu usul faqatgina virusning miqdorini aniqlashdan tashqari, kasallangan o’simlik to’qimalarida joylashgan o’rnini aniqlashda ham katta ahamiyatga egadir.
3) Immunoferment analizi (IFA). Keyingi yillarda nishon sifatida biokatalizatorlar - fermentlar ishlatilmoqda. Bu holda ferment o’tkazadigan reaksiya immunoreaksiyani o’ziga xos "molekulali kuchaytirgich" bo’lib xizmat qiladi. Immunoferment usuli mikroorganizmlarni, viruslarni va boshqa tur moddalarni aniqlashda maxsus o’rin egallaydi va immunologiya usullari orasida fitoviruslarni aniqlaydigan eng sezgir usul hisoblanadi.
1976 yilda Adams va Klark o’simlik viruslarini aniqlashda birinchi marta IFA ni qo’lladi. Bu usulning mohiyati shundan iboratki, ferment yoki uning kofaktori o’tadigan kimyoviy reaksiyani tezlatadi.
Hozirgi vaqta ishlatiladigan IFA 4 prinspga asoslangandir: titrlash, konkurensiya, ekranlanish va "sendvich"tur. Bu prinsplardan o’simlik viruslari aniqlash amaliyotida eng ko’p qo’llaniladigan "sendvich" turidir. Bu prinspni qo’llab, virus aniqlash quydagicha amalga oshiriladi. Polistirol platalarga aniqlanadigan virusning immunoglobulinlari immobilizasiya qilinadi, so’ngra ortiqcha At lar yuvib tashlanadi va aniqlanadigan virus namunasi qo’yiladi. Ma’lum vaqt inkubasiya qimlinib konyugatning ham ortiqchasi yuvib tashlanadi va nishon sifatida ishlatilgan fermentga xos substrat solinadi. Substratni ferment tomonidan parchalanganda hosil bo’lgan modda rangi bo’ladigan bo’lsa platalarda yorqin rang hosil bo’ladi. Rangni ko’p yoki kamligi viruni borligini yoki kamligini yoki yo’qligini ko’rsatadi. Ferment-substrat parasini moslab, u yoki bu substratni ishlatib hosil bo’lgan moddalarni rangi, elektr o’tkazuvchanligi, rN o’zgarishi, birorta moddani hosil bo’lishi yoki yuqolishiga qarab ishlatiladigan IFA usulini aniqlagich apparatlarini tuzish va ularni avtomatlashagan holda aniqlashga o’tkazish mumkin. Ba’zi vaqtlarda mikroplatalarga immunoglobulinlar yopishtirilib o’tirmasdan, to’g’ridan-to’g’ri aniqlanadigan virus (AG) yopishtiriladi va qolgan aniqlash yo’llari yuqorida ko’rsatilganidek olib boriladi. Bu usulga IFA ning “sindvich” turining “to’g’ri” xili deyiladi.
IFAning boshqa bir xiliga esa “noto’g’ri” “sindvich” xili deyiladi. Bu xilda platalarni AT lar bilan sensibilizasiya qilib yoki qilmasdan ham ishlatish mumkin,ferment bilan immunoglobulinlar emas AT lar nishonlanadi. Qolgan aniqlash ishlari yuqoridagidek olib boriladi.
IFA usulini sezgirligini oshirishning yo’llaridan biri tozalangan AT lar ishlatishdir. AT larni tozalashni ammoniy sulfati, polietilinglikol kabi cho’ktiruvchi moddalar bilan gammaglobulin fraksiyalarini olish kabi usullari o’rniga xromatagrafiya, ayniqsa, biospesifin xromatografiya usullari katta natijalar bermoqda. Hozirgi vaqtda ATlarni olishni gen injenerligi yordamida amalga oshirish ishlari yo’lga qo’yilmoqda. Olingan ATlar ma’lum antigen detrmenantga hos bo’lgani uchun uni monoklonal AT deyiladi. Virus oqsilining yuzasida bir necha aminokislota qoldig’idan iborat antigen detrmenantalar bo’lib ularga epitop deyiladi. Shuning uchun ham hayvon qonidan olingan zardobda ko’pgina har xil AT lar tipi uchraydi. Ularning har biri oqsil molekulasining birorta epitopiga mos bo’ladi. AT ni har bir tipi o’zining V limfoset kloni tomonidan hosil bo’ladi. Hosil bo’lgan AT lar monoklonal AT lar deyiladi (MKAT). MKAT ishlatish virus shtammlarini nozik serotiplarga guruhlashda juda qo’l keladi. Masalan, TMV ning o’nta shtammini serotiplarga ajratish MKAT ishlatgan holda IFA usulida aniqlanganda yetti har turli shtammlardan iborat ekanligi aniqlanadi.
. Viruslar tasnifi, morfologiyasi va tuzilishi
Viruslar barcha organizm hujayralarida ko’payadigan, xususiy genomga ega bo’lib, hujayralardan tashqarida yashay olmaydi. Ular odam, hayvon, hasharot, o’simlik, zamburug’ va bakteriyalarning obligat hujayra ichida yashovchi parazitlari bo’lib, oqsilni sintezlash, ferment va energiya hosil qilish xususiyatiga ega emas.
Viruslar taksonomiyasi bilan shug’ullanuvchi Xalqaro qo’mita tasnifida (1982) viruslar kimyoviy tarkibiga ko’ra, asosan, ikki guruhga bo’linadi:
1) DNK tutuvchi viruslar; 2) RNK tutuvchi viruslar. DNK tutuvchi viruslarning 17 DNK-genomli va RNK tutuvchi viruslarning 42 RNK-genomli oilasi ma’lum. Ulardan 6 ta DNK-genomli va 13 ta RNK-genomli oila, tibbiyot va veterinariyada ahamiyatga ega.
Viruslar tasnifida ulardagi nuklein kislotaning turi va uning viriondagi foiz miqdori kapsomerlar soni, nisbiy molekulyar og’irligi, viruslarning tuzilish xususiyatlari, reproduksiyasi va boshqa ma’lumotlar hisobga olinadi .