Mavzu: Oqsillardagi barqarorlik va aylanish

Oqsillardagi barqarorlikni tahlil qilish. Folding degradatsiyasi

Binaza/barnaza holatida kuzatilgan barqarorlikning tor oynasining muqobil tushuntirishi shundaki, faollik va barqarorlik teskari bog'liqdir, ferment samarali katalizator bo'lishi uchun u moslashuvchan bo'lishi kerak, bu esa barqarorlikning pasayishiga olib keladi. Bu fikr gipertermofil organizmlarning fermentlari mezofil haroratlarda past faollikka ega ekanligini kuzatish asosida taklif qilingan (masalan , Hensel, 1993).). Men bu tushuntirish noto'g'ri deb hisoblayman. Giper-termofil oqsiliga evolyutsion bosim kerak bo'lganda barqaror va kerak bo'lganda faol bo'lishi kerak. Agar mezofil oqsil past haroratda bo'lgani kabi gipertermofil oqsil yuqori haroratda faol bo'lsa (ya'ni organizm uchun etarli) oddiy termodinamika bizga past haroratda yomon ishlashini aytadi. Kimyo tamoyillari shuni ko'rsatadiki, kataliz uchun katta aylana harakati zarur bo'lgan holatlar bundan mustasno, fermentning egiluvchanligiga muhtoj bo'lgan qismlari faqat yon zanjirlar va guruhlarga kerak .o'tish davri rivojlanishi davrida harakat qilish. Bundan tashqari, men bilgan barcha ishlarda mezofil oqsillar saytga yo'naltirilgan mutagenez tomonidan barqarorlashtirilgan (shu jumladan ushbu dissertatsiyada tasvirlanganlar) faollikka hech qanday tizimli ta'sir ko'rsatmagan, aksariyat hollarda neytraldir.
Ushbu dissertatsiya protein barqarorligiga kichik va qarama-qarshi hissa qo'shadigan ko'plab kuchlarning ba'zilarini muhokama qildi. Aynan shu turli barqarorlashtiruvchi va beqarorlashtiruvchi o'zaro ta'sirlarning yig'indisi oqsilning yakuniy barqarorligini keltirib chiqaradi. Umumiy beqarorlashtiruvchi va jami barqarorlashtiruvchi energiyalar ikkalasi ham katta va ularning farqi kichik. Bu hozirgi hisoblash usullari protein barqarorligini strukturadan bashorat qilish uchun kurashayotganining sabablaridan biridir.
Bundan tashqari, bizning bu ko'p kuchlar haqidagi tushunchamiz to'liq emas; ko'pincha mutatsiyalar bashorat qilinganiga teskari ta'sir ko'rsatadi. Bundan tashqari, katlamaning faollashuv energiyasi ham kinetik barqarorlikni, ham oqsilning global minimal darajaga tushishini aniqlashning muhim omilidir. Shu bilan birga, katta yutuqlarga erishilgani va biologiyadagi eng katta savollardan biri bo'lgan "Qatlama muammosi" yechimini izlash juda hayajonli va shunday bo'lib qolmoqda.
Protein qatlamlari: suvning rolini va Reynolds sonining past muhitini tushunish, chunki peptid zanjiri ribosoma va burmalardan paydo bo'ladi.
Jarayonning dastlabki bosqichlarida oqsillarni katlama mexanizmi uchta determinantga ega. Birinchidan, harakatlanuvchi suv molekulalari inertial komponentsiz past Reynolds soni fizikasi qoidalariga bo'ysunadi. Molekulyar harakat bir zumda va o'lchamga sezgir emas. Ribosomadan chiqadigan oqsillar tashqi kuchsiz harakatlanadi va aylanadi, agar ular shaklini o'zgartirsa, translokatsion samaradorlikni oshiradigan spiral tuzilmalarni hosil qiladi va ko'paytiradi. Shakl o'zgarganda yoki harakatlantiruvchi kuch to'xtasa, oldinga harakat to'xtaydi. Ikkinchidan, kvant maydoni nazariyasini suv tuzilishiga tatbiq etish erigan atmosfera gazlarini chiqarib yuboradigan qattiq o'lchamdagi past zichlikdagi kogerent birliklarning o'z-o'zidan paydo bo'lishini taxmin qiladi. Ham kogerent, ham kogerent bo'lmagan domenlarga ega tuzilgan suv qatlamlari yangi oqsil atrofida qobiq hosil qiladi. Hidrofob aminokislotalarning yuzasi suv bilan aloqa qilishdan erigan atmosfera gazlarining kichik nano pufakchalari, o'rtacha 5 yoki 6 molekula bilan himoyalangan, ular tebranadi va hatto keng tarqalgan rezonansli nanopufakchalarni ham o'ziga tortadi. Bu kuch kvant effektlaridan kelib chiqadi, faqat tizim tebranish elektromagnit maydon ichida bo'lganda va u bilan o'zaro ta'sir qilganda paydo bo'ladi. Yangi e'tirof etilgan kvant kuchi peptidni keskin egib, oqsillarni katlama yo'lini belgilovchi dinamik maydonning bir qismidir.
Uchinchidan, oqsillarning uchinchi darajali qatlamlanishini qo'zg'atuvchi kuch har bir hidrofobik aminokislota holatidagi burmalardan kelib chiqadi, bu hidrofobik aminokislotalarning sirt ta'sirini kamaytiradi va oqsil bo'ylab tarqaladi. Umumiy egilish 360 ° ga yetganda, suv qobig'ining etakchi segmenti orqa segmentni kesib o'tadi. Ushbu sterik o'z-o'zidan kesishish suvni qobiqning bir-biriga yopishgan segmentlaridan chiqarib yuboradi va Nyutonning ikkinchi qonuniga binoan polipeptid zanjirini teskari yo'nalishda harakatga keltiradi. Binobarin, biz sanab o'tadigan va muhokama qiladigan juda kam istisnolardan tashqari, uchinchi darajali tuzilmalar oqsillarni katlamaning dastlabki bosqichlarini va oqsilning umumiy shaklini boshqaradigan hidrofobik aminokislotalarsiz oqsillarda mavjud emas. Shunday qilib, oqsillar faqat cheklangan miqdordagi shakllarni qabul qiladi. To'rtlamchi tuzilmalarning shakllanishi hidrofobik aminokislotalarning yo'qligi bilan har doim ham to'sqinlik qilmaydi. uchinchi darajali tuzilmalar hidrofobik aminokislotalarsiz oqsillarda yo'q, ular oqsillarni katlamaning dastlabki bosqichlarini va oqsilning umumiy shaklini nazorat qiladi. Shunday qilib, oqsillar faqat cheklangan miqdordagi shakllarni qabul qiladi. To'rtlamchi tuzilmalarning shakllanishi hidrofobik aminokislotalarning yo'qligi bilan har doim ham to'sqinlik qilmaydi. uchinchi darajali tuzilmalar hidrofobik aminokislotalarsiz oqsillarda yo'q, ular oqsillarni katlamaning dastlabki bosqichlarini va oqsilning umumiy shaklini nazorat qiladi. Shunday qilib, oqsillar faqat cheklangan miqdordagi shakllarni qabul qiladi. To'rtlamchi tuzilmalarning shakllanishi hidrofobik aminokislotalarning yo'qligi bilan har doim ham to'sqinlik qilmaydi.
Fiziologik sharoitda oqsil o'z-o'zidan tartibsizlik ⇌ "katlama" deb ataladigan o'tishni boshdan kechiradi. Protein polimeri ochilganda juda moslashuvchan, lekin katlanganda o'zining noyob, uch o'lchovli tuzilishini qabul qiladi. Hozirgi eksperimental bilimlar, birinchi navbatda, eritmadagi termodinamik o'lchovlardan yoki rentgen kristallografiyasi yoki NMR spektroskopiyasi orqali aniqlangan alohida molekulalarning tuzilmalaridan kelib chiqadi. Birinchisidan biz turli xil erituvchi/kosolvent sharoitlarida yuzlab oqsillarning buklangan va ochilgan shakllari o'rtasidagi entalpiya, entropiya va erkin energiya farqlarini bilamiz. Ikkinchisidan biz vodorod bilan bog'langan strukturaviy elementlar, a-spiral va b-varaqning iskalalarida qurilgan ≈35 000 oqsilning strukturalarini bilamiz. Anfinsen aminokislotalar ketma-ketligining o'zi oqsil tuzilishini aniqlash uchun etarli ekanligini ko'rsatdi, ammo o'z-o'zini yig'ish uchun javobgar bo'lgan molekulyar mexanizm ochiq savol bo'lib qolmoqda, ehtimol biokimyodagi eng asosiy ochiq savol. Bu istiqbol gibriddir: qisman ko'rib chiqish, qisman taklif. Birinchidan, biz so'nggi yarim asrda ishlab chiqilgan va hozirgi tafakkur bilan yakunlangan oqsil qatlamlari haqidagi asosiy g'oyalarni umumlashtiramiz. Shu nuqtai nazardan, yon zanjirning o'zaro ta'sirining energetikasi katlama jarayonida ustunlik qiladi, bu zanjirni katlama sharoitida o'z-o'zini tashkil etishga undaydi. Keyinchalik, inventarizatsiyadan so'ng, biz ustunlikdagi yon zanjir/umurtqa paradigmasini o'zgartiradigan muqobil modelni taklif qilamiz. Bu erda umurtqa pog'onasi vodorod bog'larining energiyalari katlama jarayonida ustunlik qiladi, burmalangan holatda oldindan tashkil etish.
Ukturalarini bilamiz. Anfinsen aminokislotalar ketma-ketligining o'zi oqsil tuzilishini aniqlash uchun etarli ekanligini ko'rsatdi, ammo o'z-o'zini yig'ish uchun javobgar bo'lgan molekulyar mexanizm ochiq savol bo'lib qolmoqda, ehtimol biokimyodagi eng asosiy ochiq savol. Bu istiqbol gibriddir: qisman ko'rib chiqish, qisman taklif. Birinchidan, biz so'nggi yarim asrda ishlab chiqilgan va hozirgi tafakkur bilan yakunlangan oqsil qatlamlari haqidagi asosiy g'oyalarni umumlashtiramiz. Shu nuqtai nazardan, yon zanjirning o'zaro ta'sirining energetikasi katlama jarayonida ustunlik qiladi, bu zanjirni katlama sharoitida o'z-o'zini tashkil etishga undaydi. Keyinchalik, inventarizatsiyadan so'ng, biz ustunlikdagi yon zanjir/umurtqa paradigmasini o'zgartiradigan muqobil modelni taklif qilamiz. Bu erda umurtqa pog'onasi vodorod bog'larining energiyalari katlama jarayonida ustunlik qiladi, burmalangan holatda oldindan tashkil etish. Keyin,
PNAS ogohlantirishlari uchun ro'yxatdan o'ting.
Yangi maqolalar haqida ogohlantirish oling yoki maqola keltirilsa, ogohlantirish oling.
Proteinlar aminokislotalar qoldiqlarining chiziqli, tarvaqaylab ketgan polimerlari bo'lib, ular oqsil burmalari deb ataladigan ⇌ tartibli o'tish jarayoniga qaytishi mumkin. Tegishli sharoitlarda ko'pchilik oqsillarning tartiblangan shaklini amalga oshirish uchun zarur bo'lgan barcha ma'lumotlar ularning chiziqli ketma-ketligida kodlangan; Tartibsiz zanjirni o'zining noyob, biologik jihatdan tegishli uch o'lchovli tuzilishiga yo'naltirish uchun hech qanday yordamchi komponentlar kerak emas ( 1 ). Bir oz tuzli suvda va fiziologik haroratda ko'pchilik oqsillar o'z-o'zidan yig'iladi.
Aslida, ko'pchilik biologik komponentlar o'z-o'zidan o'z-o'zidan yig'iladi, uchta asosiy shablonga asoslangan jarayon (ko'paytirish, transkripsiya va tarjima) dan tashqari. Ribosoma kabi kattaroq birikmalar iterativ tarzda kichikroq kompozitlardan o'z-o'zidan yig'iladi, yuqoridan pastga tuzilmaviy ierarxiya bo'lib, oxir-oqibat oqsil monomerlari bilan tugaydi va ular o'zlarini yig'adilar. Hayot o'z-o'zini yig'ish jarayonlariga asoslanadi va biz oqsillarni katlamadan boshlab ularni tushuntirishga harakat qilamiz. Biroq, Gyote aytganidek, "Ko'rish eng qiyin narsa - bu bizning ko'z o'ngimizda bo'lgan narsadir".
Ushbu nuqtai nazar so'nggi yarim asrlik tadqiqotlar davomida ularning rivojlanishini kuzatib, hozirgi fikrlashga turtki bo'lgan asoslarni ochishga harakat qiladi. Keyin biz hozirgi fikrlash tarziga shubha qilamiz va ma'lum faktlarni tubdan boshqacha talqin qilishni taklif qilamiz. Qisqacha aytganda, yon zanjirning o'zaro ta'siri birinchi navbatda oqsillar orasidagi konformatsion farqlar uchun javobgardir, chunki qoldiq magistrallar kimyoviy jihatdan ekvivalent va shuning uchun kamsituvchi kuchga ega emas. Ushbu to'g'ri fikrdan farqli o'laroq, biz, aslida, umurtqa pog'onasi katlamni aniqlash uchun birinchi navbatda javobgar ekanligini taklif qilamiz, chunki katlama jarayonida peptid vodorod aloqalari hukmronlik qiladi. Hatto molekulyar ichki qismdagi bir yoki ikkita qoniqtirilmagan vodorod aloqalari ham odatdagi globulyar oqsil uchun katlamaning butun erkin energiyasini muvozanatlashtiradi. Albatta, boshqa omillar ham buklangan holatni ma'qullaydi yoki rad etadi, ammo magistral vodorod bog'lanishi ularning barchasidan ustundir.
Bu erda biz qat'iy burilishlar va halqalar bilan o'zaro bog'langan a-spiral va b-ipchalarning burmasi, iskala va bu molekulyar skeletda ishlab chiqilgan batafsil atom tuzilishini ajratamiz. Yagona domenli oqsillar uchun faqat cheklangan miqdordagi skafoldlar mumkin; boshqalar sterik mumkin emasligi va/yoki vodorod bog'lanishini qondirishning yo'qligi bilan istisno qilinadi. Ushbu magistralga asoslangan nazariya osmolitlarni himoya qiluvchi eritma termodinamikasidan yordam oladi, bu esa o'z ta'sirini yon zanjirlarga emas, balki asosan umurtqa suyagiga ta'sir qilish orqali buklanishni kuchaytiradi. Endi biz ushbu g'oyalarni batafsil ishlab chiqamiz. qattiq burilishlar va halqalar bilan o'zaro bog'langan a-spirallar va b-torlar iskala va bu molekulyar skeletda ishlab chiqilgan batafsil atom tuzilishi. Yagona domenli oqsillar uchun faqat cheklangan miqdordagi skafoldlar mumkin; boshqalar sterik mumkin emasligi va/yoki vodorod bog'lanishini qondirishning yo'qligi bilan istisno qilinadi. Ushbu magistralga asoslangan nazariya osmolitlarni himoya qiluvchi eritma termodinamikasidan yordam oladi, bu esa o'z ta'sirini yon zanjirlarga emas, balki asosan umurtqa suyagiga ta'sir qilish orqali buklanishni kuchaytiradi. Endi biz ushbu g'oyalarni batafsil ishlab chiqamiz. qattiq burilishlar va halqalar bilan o'zaro bog'langan a-spirallar va b-torlar iskala va bu molekulyar skeletda ishlab chiqilgan batafsil atom tuzilishi. Yagona domenli oqsillar uchun faqat cheklangan miqdordagi skafoldlar mumkin; boshqalar sterik mumkin emasligi va/yoki vodorod bog'lanishini qondirishning yo'qligi bilan istisno qilinadi. Ushbu magistralga asoslangan nazariya osmolitlarni himoya qiluvchi eritma termodinamikasidan yordam oladi, bu esa o'z ta'sirini yon zanjirlarga emas, balki asosan umurtqa suyagiga ta'sir qilish orqali buklanishni kuchaytiradi. Endi biz ushbu g'oyalarni batafsil ishlab chiqamiz. boshqalar sterik mumkin emasligi va/yoki vodorod bog'lanishini qondirishning yo'qligi bilan istisno qilinadi. Ushbu magistralga asoslangan nazariya osmolitlarni himoya qiluvchi eritma termodinamikasidan yordam oladi, bu esa o'z ta'sirini yon zanjirlarga emas, balki asosan umurtqa pog'onasiga ta'sir qilish orqali katlanishga yordam beradi. Endi biz ushbu g'oyalarni batafsil ishlab chiqamiz. boshqalar sterik mumkin emasligi va/yoki vodorod bog'lanishini qondirishning yo'qligi bilan istisno qilinadi. Ushbu magistralga asoslangan nazariya osmolitlarni himoya qiluvchi eritma termodinamikasidan yordam oladi, bu esa o'z ta'sirini yon zanjirlarga emas, balki asosan umurtqa pog'onasiga ta'sir qilish orqali katlanishga yordam beradi. Endi biz ushbu g'oyalarni batafsil ishlab chiqamiz.
Proteinlar o'z-o'zidan o'z-o'zidan yig'ilishi mumkinligi haqidagi xulosa Anfinsenning Nobel mukofotiga sazovor bo'lgan tajribalariga asoslangan bo'lib, unda protein ribonukleazasi probirkada teskari denatüratsiya/renaturatsiya qilinishi mumkin ( 2 ). Tuzilishi ham, biologik faolligi ham denaturatsiya sharoitida bekor qilinadi, lekin fiziologik sharoitga qaytgandan so'ng o'z-o'zidan tiklanadi. O'shandan beri Anfinsen tajribasidagi o'zgarishlar yuzlab yoki minglab boshqa oqsillar uchun muvaffaqiyatli takrorlandi. Kamroq tartibli populyatsiyadan ko'proq tartiblangan populyatsiyaga o'z-o'zidan buklanadigan o'tish tushuntirishni talab qiladi.
Anfinsenning o'z tushuntirishi termodinamik gipoteza bo'lib, u fiziologik sharoitda oqsil populyatsiyasi o'zining tug'ilgan holatida Gibbsning erkin energiyasida minimal darajaga etadi, degan postulatdir. Shu nuqtai nazardan, oqsil eritmasidagi har bir alohida molekula ochiladigan sharoitlarda astronomik darajada tasavvur qilinadigan konformatsiyalarni qabul qilishi mumkin. Katlama sharoitiga o'tgandan so'ng, butun populyatsiya o'z-o'zidan oqsilning o'zi va uning erituvchi muhiti bilan o'zaro ta'sirini optimallashtiradigan konformatsiya tomon yo'naltiriladi. Boshqacha qilib aytganda, katlamali o'tish kimyoviy potentsialni minimallashtirish uchun o'z-o'zidan harakatlanishning natijasidir. Gibbs kimyoviy potentsialni potentsial energiyaning boshqa ifodalariga, masalan, elektr potentsialiga o'xshash qilib yaratdi. kuchlanish darajasidagi har qanday farqni minimallashtirish uchun oqim ikki qutb o'rtasida o'z-o'zidan oqadi. Keyingi talqinlarga qaramay, termodinamik gipoteza oddiygina oqsillar erkin energiya tepaligidan dumalab tushayotgan to'p kabi o'zlarining tabiiy holatiga buklanishlari haqidagi bayonotdir.
Anfinsen, ko'p yillar oldin Vu ( 3 ) va Mirskiy va Pauling ( 4 ) singari, aniq termodinamik nuqtai nazardan oqsil katlamasini tuzdi. Orqaga nazar tashlaydigan bo'lsak, bu yondashuv hali ham to'liq mos ko'rinadi. Eksperimental qiziqish uyg'otadigan ko'plab kichik oqsillar hamma yoki hech qanday tarzda katlanadi ( 5 ). Harorat yoki kimyoviy denaturant kabi strukturani buzuvchi omilning populyatsiyaning katlamli qismiga nisbatan grafigi sigmasimon (ya'ni, yuqori darajada kooperativ) egri ( 6 ) hosil qiladi ( 1-rasm).). Egri chiziqning o'rta nuqtasida aholining yarmi buklangan, yarmi ochilgan va qisman buklangan oraliq mahsulotlarning populyatsiyasi ahamiyatsiz. Bunday xatti-harakatlar oraliq holatlarning ketma-ketligini kuzatish orqali reaktsiyani kuzatishga intilayotgan kimyogar uchun umidsizlikdir. Ammo bu termodinamist uchun soddalashtiruvchi tasodif bo'lib, u endi katlama jarayonini K eq = [N]/[U] muvozanat konstantasi bilan haqiqiy kimyoviy muvozanat, U(nkatlangan) ⇌ N(ative) sifatida ifodalay oladi. buklangan va ochilgan populyatsiyalar orasidagi erkin energiya farqi D G konformatsion0 = - RT ln K ekv ( R - gaz konstantasi; T - mutlaq harorat). DG konformatsion0 yuzlab oqsillar uchun o'lchandi va odatiy qiymatlar -5 dan -15 kkal / mol ( 7 ) orasida tor diapazonga to'g'ri keladi.
Edman degradatsiyasi oqsillarni tavsiflash uchun qimmatli vosita bo'lib qolmoqda N-terminus.
 Odatda buyurtma qilingan ketma-ketlikni topishga urinishdan oldin oqsilning tartibsiz aminokislota tarkibini bilish maqsadga muvofiqdir, chunki bu bilimlar ketma-ketlikdagi xatolarni aniqlashni osonlashtirish yoki noaniq natijalarni farqlash uchun ishlatilishi mumkin. Ayrim aminokislotalarning chastotasi haqidagi bilimlardan qaysi birini tanlash uchun foydalanish mumkin proteaz oqsilni hazm qilish uchun ishlatish. Past darajadagi nostandart aminokislotalarning (masalan, norleusin) oqsillarga noto'g'ri qo'shilishi ham aniqlanishi mumkin.^[1] Odatda deb ataladigan umumlashtirilgan usul aminokislotalar tahlili^[2] aminokislotalar chastotasini aniqlash uchun quyidagilar:

1. 
   Ma'lum miqdordagi oqsilni tarkibiga kiruvchi aminokislotalarga gidroliz qiling.
   
2. 
   Aminokislotalarni qandaydir tarzda ajratib oling va miqdorini aniqlang.