Mavzu: Oqsillardagi barqarorlik va aylanish

Kurs ishining maqsad va vazifalari. Oqsillardagi barqarorlik va aylanish (Folding) mavzusini o’rganish hama mutatsion kasalliklarning oldini olish chora tadbirlarini rivojlantirishdan iborat.
Kurs ishining tuzilishi: Kurs ishi kirish ,asosiy qism, xulosa 3 ta rasm, foydalanilgan adabiyotlar ro’yxati, Jami 26 betdan iborat


I BOB Oqsillardagi barqarorlik va aylanish (Folding)

1. 
   Oqsillardagi barqarorlik va aylanish
   

Oqsillarni ketma-ketligi ni aniqlashning amaliy jarayoni aminokislotalar ketma-ketligi a yoki qisman oqsil yoki peptid. Bu oqsilni aniqlashga yoki uning xarakteristikasiga xizmat qilishi mumkin tarjimadan keyingi modifikatsiyalar. Odatda, oqsilning qisman ketma-ketligi, uni kontseptual asoslardan kelib chiqqan oqsillar ketma-ketligining ma'lumotlar bazalariga asoslanib aniqlash uchun etarli ma'lumot (bir yoki bir nechta ketma-ketlik yorliqlari) beradi. tarjima ning genlar.
Proteinlarni ketma-ketlikning ikkita asosiy to'g'ridan-to'g'ri usullari mass-spektrometriya va Edman degradatsiyasi yordamida oqsil sekvenatori (sekvensiya). Ommaviy spektrometriya usullari hozirgi kunda oqsillarni ketma-ketligi va identifikatsiyasi uchun eng keng qo'llaniladi, ammo
Oqsillardagibarqarorlik va aylanish
Ushbu hujjatda men protein barqarorligi haqida umumiy ma'lumot beraman. Har bir qoldiqning oqsil barqarorligiga qo'shadigan yoki olib tashlaydigan hissasi kichikdir. Shunday qilib, oqsilning barqarorligi ko'p miqdordagi kichik ijobiy va salbiy o'zaro ta'sir energiyalari bilan belgilanadi. Keyingi bo'limlarda men ushbu ijobiy va salbiy o'zaro ta'sir energiyalarini keltirib chiqaradigan ba'zi omillarni muhokama qilaman. Men shuningdek, idrok etilgan barqarorlik ( kinetik barqarorlik) , oqsillarning kimyoviy degradatsiyasi va barqarorlik evolyutsiyasi bilan bog'liq bo'lgan rivojlanish tezligini qisqacha muhokama qilaman .Proteinlardagi barqarorlik haqida bahslashishdan oldin, biz barqarorlik deganda nimani nazarda tutayotganimizni aniq belgilashimiz kerak. Bu so'z turli odamlar tomonidan turlicha qo'llaniladi. Masalan, fizik biokimyogar va biotexnolog barqarorlik haqida gapirganda har xil narsani anglatishi mumkin.
Jismoniy biokimyogar, bir tomondan, oqsil barqarorligini birinchi navbatda tez, teskari, hamkorlikda va oddiy, ikki holatli mexanizm bilan ochiladigan va qayta katlanadigan oqsilning termodinamik barqarorligi nuqtai nazaridan muhokama qiladi:
Buklanish va barqarorlikni o'rganish uchun eng oson oqsillar bu tez qaytarilish xususiyatini ko'rsatadigan oqsillardir. Eksperimental dizayn ham, ma'lumotlarning nazariy ishlovi ham qaytariladigan tizimlar tomonidan soddalashtirilgan. Shunday qilib, barqarorlik to'g'risidagi ko'pgina adabiyotlarda bu turdagi teskari tizimni muhokama qilish ajablanarli emas. Ushbu dissertatsiyaning asosiy qismi termodinamik barqarorlikka ham qaratiladi.
Bunday hollarda oqsilning barqarorligi oddiygina Gibbs erkin energiyasidagi farq, G, buklangan va ochilgan holatlar o'rtasidagi farqdir. Barqarorlikka ta'sir etuvchi omillar buklangan (G f ) va ochilgan (G u ) holatlarning nisbiy erkin energiyalaridir. G u qanchalik katta va ijobiy bo'lsa, oqsil denaturatsiyaga shunchalik barqaror bo'ladi.
Gibbsning erkin energiyasi, G, tenglama bilan bog'liq bo'lgan ikkita entalpiya (H) va entropiya (S) atamalaridan iborat:
Katlanuvchi erkin energiya farqi, G u , odatda kichik bo'lib, globulyar oqsil uchun 5-15 kkal/mol (masalan, kovalent bog'lanish uchun ~30-100 kkal/mol bilan solishtirganda).
Boshqa tomondan, biotexnolog ta'rifning amaliy foydasi bilan ko'proq shug'ullanadi: oqsil qattiq harorat yoki erituvchi sharoitida ishlash uchun etarlicha barqarormi? Bu savolga javob termodinamik barqarorlikda bo'lishi mumkin bo'lsa-da (yuqorida muhokama qilingan); u oddiygina qaytaruvchanlikda yoki qaytarilmas yoki asta-sekin ochiladigan oqsillar uchun kinetik barqarorlikda yotishi mumkin.
Agar oqsil teskari yo'l bilan ochilgan bo'lsa, u yuqori haroratlarda to'liq ochilishi va faol bo'lmasligi mumkin, lekin u xona haroratiga soviganidan so'ng, u qayta tiklanadi va faollikni to'liq tiklaydi. Funktsional nuqtai nazardan, bu uning termostabil deb tasniflanishi uchun zarur bo'lgan barcha narsa bo'lishi mumkin. Biroq, termodinamik nuqtai nazardan (va ushbu dissertatsiya nuqtai nazaridan) u termostabil bo'lmagan deb tasniflanadi.
Qaytarib bo'lmaydigan yoki asta-sekin ochiladigan oqsillar bo'lsa, kinetik barqarorlik yoki ochilish tezligi muhim ahamiyatga ega. Kinetik jihatdan barqaror bo'lgan oqsil kinetik jihatdan beqaror proteinga qaraganda sekinroq ochiladi. Kinetik barqaror oqsilda ochilish uchun katta erkin energiya to'sig'i talab qilinadi va barqarorlikka ta'sir etuvchi omillar ochilish yo'lidagi birinchi qat'iy qadam uchun buklanganlarning nisbiy erkin energiyalari (G f ) va o'tish holati (G ts ) hisoblanadi. Kinetik barqarorlik o'z bo'limida batafsilroq muhokama qilinadi; qarang Kinetik barqarorlik . Protein qatlamli tuzilishining qaytarilmas yo'qolishi quyidagilar bilan ifodalanadi:
Bu yerda k i - qaytarilmas inaktivatsiya jarayoni uchun tezlik konstantasi.
Tez faolsizlanayotgan oqsil uchun erkin energiya profili quyida ko'rsatilgan. E'tibor bering, katlanmış shaklga erishilgandan so'ng, inaktivatsiya uchun energiya to'sig'i qayta katlamaga qaraganda pastroq bo'ladi.Protein barqarorligiga ta'sir qiluvchi asosiy omillar
hidrofobik o'zaro ta'sirlar
vodorod aloqalari
konformatsion entropiya
Adabiyotlar oqsillarda eng ko'p tarqalgan ikki turdagi o'zaro ta'sirlar (i) hidrofobik o'zaro ta'sirlar va (ii) vodorod aloqalari ekanligi haqida umumiy kelishuv mavjud . Ushbu bog'lanishlarning ochilgan holatdan buklangan holatga o'tishdagi reaktsiyasi quyidagi multfilmda jamlangan.
Hidrofobik qismlarning ko'milishi va oqsil katlamalarida molekula ichidagi H-bog'larning shakllanishi ko'rsatilgan diagramma. Buklanish paytida suv molekulalarining ajralib chiqishiga e'tibor bering. ( Pace va boshq. , 1996 dan olingan .)
Garchi bu ikkala o'zaro ta'sir bir qoldiq uchun kichik bo'sh energiyaga ega bo'lsa-da, ular juda muhim, chunki ular juda ko'p. Xuddi shu narsa ochilgan holatni barqarorlashtiradigan o'zaro ta'sirlar uchun ham amal qiladi. Ulardan eng muhimi konformatsion entropiyadir . Shunday qilib, katlanmış oqsilning umumiy erkin energiyasi ikkita katta son orasidagi kichik farq bilan beriladi. Bu protein barqarorligini miqdoriy hisoblashning qiyinligining asosiy sababidir. RNase T1 barqarorligiga hissa qo'shadigan omillarning yaqinda o'tkazilgan tahlilida barqarorlashtiruvchi va beqarorlashtiruvchi o'zaro ta'sirlar mos ravishda 271 va 286 kkal / mol deb baholandi ( Peys va boshq. , 1996) .). Vodorod bilan bog'lanish va gidrofobik o'zaro ta'sirlar barqarorlashtiruvchi o'zaro ta'sirlarga 260 kkal / mol hissa qo'shishi taxmin qilingan, beqarorlashtiruvchi omillarning asosiy qismi katlamalarda konformatsion entropiyaning yo'qolishi va peptid va qutbli guruhlarning noqulay ko'milishiga bog'liq. Jadvalga qarang.
Beqarorlashtiruvchi
Erkin energiya (kkal/mol)
Konformatsion entropiya -177
Ko'milgan peptid guruhlari -81
Dafn etilgan qutbli guruhlar -28
Umumiy beqarorlik -286
Stabillashtirish
Histidinning ionlanishi +4
Disulfid aloqalari +7
Ko'milgan gidrofobik guruhlar +94
Vodorod aloqasi +166
Umumiy barqarorlashtirish +271
------------------------------------------------- ---------
G (taxminan) -15
G (o'lchangan) +9Protein barqarorligiga ta'sir qiluvchi boshqa omillar
Yuqorida muhokama qilinganlarga qo'shimcha ravishda bir qator boshqa o'zaro ta'sirlar mavjud ( Gidrofobik ta'sir , Vodorod aloqalari , Ochilishning konformatsion entropiyasi ), ular oqsillarning barqarorligiga hissa qo'shadi. Ushbu o'zaro ta'sirlar asosiy omillarga nisbatan kam , ammo protein barqarorligi uchun hali ham muhim ahamiyatga ega. Ularga quyidagilar kiradi:
Tuzli ko'priklar
Aromatik-aromatik o'zaro ta'sirlar
Metall bog'lash va
Disulfid aloqalariTuzli ko'priklar
Tuz ko'prigi yoki ion juftlari ikkita zaryadlangan qoldiq o'rtasidagi o'zaro ta'sirdan tashkil topgan kuchli vodorod aloqalarining maxsus shaklidir.
Tuz ko'prigining namunasi ushbu PPS havolasida topilgan.
Tuz ko'priklarining oqsil barqarorligiga qo'shgan hissasi adabiyotda biroz bahsli masaladir. Bir tomondan, mezofil oqsillarning termofil va giper-termofil analoglari tuz ko'prigi sonining ko'payishini kuzatishdir ( Tanner va boshq. , 1996 ; Perutz & Raidt, 1975 ; Perutz, 1978; Dekker va boshq., 1991). ). Boshqa tomondan, mutatsion tadqiqotlar tuz ko'priklarining barqarorlikka qo'shgan hissasi kichik ekanligini ko'rsatadi. Ehtimol, yuqori haroratlarda tuz ko'prigi barqarorlikka ko'proq hissa qo'shadi.
Horovitz va boshqalar . (1990) 1, 2 yoki 3 alanin mutantlarining barcha mumkin bo'lgan kombinatsiyalarining termodinamik siklini qurish orqali barnaza yuzasida Asp8, Asp12 va Arg110 o'rtasidagi sirt tuzli ko'prigi triadasining barqarorligini o'lchadi. Proteinning barqarorligiga erkin energiya hissasi Asp12/Arg110 juftligi uchun atigi 1,25 kkal/mol va Asp8/Arg110 juftligi uchun 0,98 kkal/mol ni tashkil qiladi. Arg 110 ni olib tashlash barqarorlikka ta'sir qilmaydi!
Barnase tuz ko'prigi gif uchun bu yerni bosing va pdb ga havola.
Boshqa tadqiqotlar ham xuddi shunday natijalarga ega ( Akke & Forsen, 1990 ). Ushbu hissalarning bunday ion juftligining kuchidan kutilgan darajada katta emasligining sabablaridan biri shundaki, tuz ko'prigi hosil qilish uchun suv bilan kuchli vodorod aloqalari uzilishi kerak. Aslida, stabilizatsiya energiyasining katta qismi ion jufti hosil bo'lganda erituvchi entropiyasining ortishidan kelib chiqishi mumkin.
Yuzaki tuz ko'priklaridan farqli o'laroq, ko'milgan tuz ko'prigidan bir sherikni olib tashlash 3-4 kkal / mol ning beqarorligiga olib keladi. Shu bilan birga, ko'milgan tuz-ko'prik triadasini yaxshi o'ralgan hidrofobik qoldiqlar bilan almashtirish (uchta zaryadlangan qoldiq holatida tasodifiy mutagenez natijasida topilgan) yoy repressorida 4,5 kkal / mol barqarorligini oshirishga olib kelishi aniqlandi ( Waldburger va boshqalar . ., 1995 ). Shunday qilib, hidrofobik shovqinlar tuz ko'prigi triadasidan ko'ra barqarorlikka ko'proq hissa qo'shadi. Bu quyida tasvirlangan va, ehtimol, ochilgan holatdan buklangan holatga o'tishda zaryadlangan guruhlarni yechish xarajatlari bilan bog'liq. Mutant R31M, E36Y, R40L.
Yovvoyi turdagi yoy repressorining giflari va mutant va pdb havolalari uchun bu yerni bosing.
Qizig'i shundaki, yovvoyi turdagi yoy repressorining mutantga qaraganda sekinroq 10 dan 1250 gacha katlanishi ham ko'rsatildi ( Waldburger va boshq. , 1996 ). Bu zaryadlangan qoldiqlarni ko'mish uchun yuqori energiya to'sig'i bilan bog'liq bo'lishi taklif etiladi. Agar bir zaryadlangan qoldiq boshqasidan oldin ko'milishi kerak bo'lsa, o'tish holati ayniqsa yuqori energiyaga ega bo'ladi. Tuz ko'prigi o'tish holatidan oldin shakllangan bo'lsa ham, tuz ko'prigining geometriyasi oqsilning bu qismi o'zining tabiiy konformatsiyasiga erishmaguncha optimal darajada bo'lmasligi mumkin. Hidrofobik o'zaro ta'sirlar kamroq sterik talabga egaAromatik-aromatik o'zaro ta'sirlar
Proteinlarda joylashgan aromatik yon zanjirlarning (Phe, Tyr va Trp) taxminan 60% aromatik juftliklarda ishtirok etadi. Model birikmalari bilan olib borilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatadiki, optimal geometriya perpendikulyar bo'lib, bir halqaning chetidagi qisman musbat zaryadlangan vodorodlar ikkinchisining pi elektronlari va qisman manfiy zaryadlangan uglerodlari bilan ijobiy ta'sir o'tkazishi mumkin. Ushbu kuzatishlar natijasida bunday o'zaro ta'sirlar oqsil barqarorligiga hissa qo'shishini kutish mumkin. Bu barnaza yuzasida Tyr13 / Tyr17 juftligi ta'sirlangan hal qiluvchi ustida sinovdan o'tkazildi ( Serrano va boshq., 1991 ). Tyr13 va Tyr17 ham Ala, ham Phe ga mutatsiyaga uchragan.
Barnazadagi Tyr13/Tyr17 aromatik o'zaro ta'sirini ko'rsatadigan gif uchun bu yerni bosing va pdb ga havola qiling.
Tyr13 yoki Tyr17 ning Phega mutatsiyasi barqarorlikning 0,30 yoki 0,41 kkal/mol, qo'sh mutantda esa 0,61 kkal/mol pasayishiga olib keladi. Ikkala gidroksil guruhi hal qiluvchi ta'siriga duchor bo'lganligi sababli (ular ochilgan holatda bo'lishi mumkin), bu kichik beqarorlikning manbai aniq emas. Shu bilan birga, er-xotin alanin mutantiga mutatsiya barqarorlikning 4,6 kkal/mol ga pasayishiga olib keladi. Ushbu beqarorlikning aksariyati tirozin qoldiqlari va oqsilning qolgan qismi o'rtasidagi o'zaro ta'sirlarning yo'qolishi bilan izohlanishi mumkin; ammo, termodinamik davrlar yordamida ma'lumotlarni tahlil qilish ( Carter, 1984 ; Horovitz & Fersht, 1990) .) ikkita aromatik guruh o'rtasidagi o'zaro ta'sir energiyasi oqsil barqarorligiga atigi 1,3 kkal/mol hissa qo'shishini ko'rsatadi. Bu ular orasidagi ko'milgan sirt maydonidan hidrofobik hissadan kutilgan barqarorlashuvdan biroz yuqoriroqdir. Bu holda, shuning uchun aromatik juftlik tufayli juda oz ko'rinadigan qo'shimcha barqarorlik mavjud.Metall bog'lash
Proteinlarning buklangan holatini barqarorlashtirishning yana bir usuli - bu metall bilan bog'lanishdir, bunda metall ionlari muvofiqlashtiriladi, odatda kislorod yoki azot atomlaridan bir juft donorlik.
Mana, PDB ning GIF rasmlari to'plamidan sinkni bog'laydigan oqsil, karboksipeptidaza A ning rasmi.
Shuningdek, Jeyn Richardsonning "Protein turisti" filmidagi misollarni ko'ring.
Tajribalar shuni ko'rsatdiki, metall bilan bog'lanish barqarorlikka 6 - 9 kkal / mol ( Braxton, 1996 va undagi havolalar) hissa qo'shishi mumkin. Biroq, bu biroz noto'g'ri, chunki taqqoslashlar apo- va holo-ferment o'rtasida; apo-fermentda ko'pincha kislotali yon zanjirlarni muvofiqlashtirishdan salbiy zaryadning beqarorlashtiruvchi klasteri mavjud. Metall bilan bog‘lanishining oqsil barqarorligiga qo‘shgan hissasini yanada adolatli baholash izo-sitoxrom c ning alfa spiraliga metall xelatlash joyi kiritilgan va u mavjud bo‘lganda barqarorlikning 1 kkal/mol ga oshishiga olib kelgan tajribadan olingan bo‘lishi mumkin. to'yingan Cu (II) ( Kellis va boshqalar , 1991 ). Yana bir qiziqarli tadqiqot Kuroki va boshqalar.(1989). Ular alfa-laktalbumin (Ca 2+ bilan bog'lanishi) va c tipidagi lizozimlarning (Ca 2+ bog'lanmagan) ketma-ketligi va uchinchi tuzilishi homolog ekanligini kuzatdilar.
Ular alfa-laktalbumindan inson C tipidagi lizozimga (Q86D/A92D) bog'lanish joyini jalb qilishdi. Mutant oqsil bir mol kaltsiy ionlarini bog'laydi va yovvoyi turga qaraganda taxminan 10 ° C yuqori optimal faollikka ega. Qizig'i shundaki, apo-ferment yovvoyi turga qaraganda taxminan 5 °C kamroq barqaror.Disulfid aloqalari
Disulfid aloqalari ikkita sistein qoldig'ining oksidlanishi natijasida hosil bo'lgan kovalent oltingugurt-oltingugurt bog'lanishini hosil qiladi, ular intra- ( misollar Jeyn Richardsonning Protein turistik kinamajida ko'rsatilgan ) yoki inter- ( ushbu PPS havolasida insulin misolida keltirilgan ) molekulyar ko'priklar bo'lishi mumkin.
Kovalent disulfid bog'lanishning entalpiyasi juda yuqori bo'lgani uchun u barqarorlikka katta hissa qo'shadi, deb tasavvur qilish mumkin . Biroq, bu bog'lanish ham buklangan , ham ochilgan holatda mavjud, shuning uchun uning erkin energiya farqiga entalpik hissasi ahamiyatsiz. Disulfid bog'lanishning barcha barqarorlashtiruvchi ta'siri yuqoridagi "Ochilishning konformatsion entropiyasi" da tavsiflanganidek, ochilgan holatning konformatsion entropiyasining pasayishidan kelib chiqadi .
Hisob-kitoblar shuni ko'rsatadiki, disulfid aloqasi o'zaro bog'lanishlar orasidagi asosiy ketma-ketlikni ajratishga qarab 2,5 - 3,5 kkal / mol stabilizatsiyaga olib kelishi kerak ( Braxton, 1996 ). Tabiiy disulfidlar alaninga mutatsiyaga uchragan yoki kimyoviy jihatdan kamaygan va bloklangan tajribalar barqarorlikni 2-8 kkal/mol gacha pasayishiga olib keladi ( Betz, 1993 va undagi havolalar). Afsuski, bu tajribalar bo'shliqlarni yoki ko'milgan qutbli guruhlarni qoldirishi yoki disulfid ko'prigini olib tashlashdan ko'ra ko'proq oqibatlarga olib kelishi sababli, faqat o'zaro bog'lanishlar tufayli barqarorlikni baholash qiyin.
Oqsillarga yangi disulfidlarning kiritilishi ham aralash natijalar berdi. T4 lizozimiga beshta disulfid kiritilgan (uning yovvoyi turida disulfidlari yo'q). Ikkisi beqarorlashmoqda va uchtasi qisqartirilgan shaklga nisbatan barqarorlashmoqda, ammo beshtasi ham yovvoyi turga nisbatan beqarorlashgan ( Betz, 1993 )! Biroq, disulfidlarni kiritish orqali muvaffaqiyatli stabilizatsiyalar mavjud: RNase Hn ning barqarorligi disulfid kiritilganda 2,8 kkal / mol ga oshadi. Ribonukleaz barnaza ichiga muhandislik disulfidlari 1,2 va 4,1 kkal / mol ( Clarke va boshq., 1995 ) barqarorligini oshirdi. Qizig'i shundaki, birinchi disulfid 34 ta qoldiqdan iborat bo'lakni o'z ichiga oladi, ikkinchisi esa 17 tani o'z ichiga oladi.

Bu barnase tuzilmalari va ularning pdb havolalari bu erda ko'rsatilgan.

Agar barqarorlashuv faqat konformatsion entropiya tufayli bo'lsa, stabilizatsiya kattaligi teskari bo'ladi; bundan tashqari, 17 qoldiq pastadir (4,1 kkal / mol) uchun kuzatilgan stabilizatsiya darajasi nazariya ( Betz, 1993 ) tomonidan bashorat qilinganidan yuqori . Shunday qilib, biz disulfidlarning oqsil tarkibidagi rolini tushunishdan hali ham uzoq ekanligimiz aniq.
Shunisi e'tiborga loyiqki, kichik oqsillar ko'pincha tabiiy ravishda disulfid aloqalariga boy ( misollar Jeyn Richardsonning Protein turistik kinamajida ko'rsatilgan ); ehtimol, geometriya optimal bo'lganda, ular kovalent bo'lmagan o'zaro ta'sirlarning kam sonini qoplaydi.
Giper termostabil oqsillarda disulfid birikmalari kamdan-kam uchraydi, chunki ular yuqori haroratlarda kimyoviy jihatdan labildir.Kinetik barqarorlik
Kinetik barqarorlik, bu erda muhokama qilingan kontekstda, oqsilning qanchalik tez tarqalishining o'lchovidir. Bu juda sekin ochiladigan yoki qaytarib bo'lmaydigan tarzda denatüratsiyalanadigan oqsillar uchun ayniqsa muhim ahamiyatga ega. Agar ochilmagan oqsil tezda agregatsiya (tuxum oqi) yoki proteolitik degradatsiya (subtilisin) kabi doimiy o'zgarishlarga duchor bo'lsa, oqsil qaytarib bo'lmaydigan tarzda denatüratsiyasi mumkin.
Bu kabi holatlarda buklangan va ochilgan holat o'rtasidagi erkin energiya farqi muhim emas. Bu faqat muvozanatga ta'sir qiladi va bu muvozanat jarayoni emas. Muhimi, buklangan va o'tish holatlari o'rtasidagi erkin energiya farqi (faollashuv energiyasi), chunki bu farqning kattaligi ochilish tezligini (va shuning uchun inaktivatsiyani) belgilaydi.
Boshqa tomondan, bu kuzatuv (teskari: ochilgandan buklangan) katlanmış oqsil struktura uchun global energiya minimalini aks ettiradi degan nazariya uchun ba'zi oqibatlarga olib keladi. Agar global minimal darajaga erishish uchun zarur bo'lgan faollashtirish energiyasi shunchalik yuqori bo'lsa, bu to'g'ri emas. Bunday holda, struktura barcha maqsad va maqsadlarga ko'ra, mahalliy minimal darajada tuzoqqa tushadi va mahalliy minimallashtirilgan struktura ushbu protein uchun buklangan holat bo'ladi.
Bu holat subtilisin tomonidan tasvirlangan, bu katlama uchun katalizator sifatida pro-ketlikni talab qiladi; yakuniy tuzilishda pro-ketlik talab qilinmaydi, lekin katlamaning faollashuv energiyasini 27 kkal/mol dan ortiq pasaytiradi. Agar bu ketma-ketlik bo'lmasa, past energiyali yakuniy katlama tuzilishiga erishib bo'lmaydi. Ushbu kontseptsiya Beyker va Agard (1994) tomonidan batafsilroq muhokama qilingan .
Qaytarib bo'lmaydigan darajada ochiladigan bir nechta oqsillarning katlanmasi / barqarorligi batafsil o'rganilganligi sababli, men barnaza disulfid mutantlarining ochilish kinetikasi bo'yicha mutatsiyali tadqiqotni muhokama qilaman ( Clarke and Fersht, 1993 ). SDM yordamida muvozanat va kinetik katlama va ochish tadqiqotlari bilan birgalikda ushbu oqsilning katlama yo'li va o'tish holati xaritaga tushirildiDisulfid aloqalari ochilish yo'lida erta buziladigan pozitsiyalarda (43/80) va ochilish yo'lida kech buziladigan pozitsiyalarda (85/102) kiritilgan. Muvozanat barqarorligi va ochiladigan kinetika o'lchandi ( Clarke and Fersht, 1993 ). (Barqarorlik avvalgi bo'limda muhokama qilingan disulfid bog'lari .) Kamroq barqaror 43/80 mutant 170 marta sekinroq va barqarorroq bo'ladi.85/102 mutant disulfid aloqasi kamaytirilgandan ko'ra 17 marta sekinroq. Shunday qilib, ochilish yo'lida erta buziladigan muhandislik disulfid bog'lovchi hududlarning mavjudligi ochilish tezligining ochilish yo'lida kech bo'lgan disulfid bog'lovchi mintaqalari mavjudligiga qaraganda 10 marta ko'proq pasayishiga olib keladi; Garchi tezroq ochiladigan mutant termodinamik jihatdan barqarorroq bo'lsa ham. Buning qaytarilmas tizimlarda kinetik barqarorlikni muhandislik yoki tekshirish uchun oqibatlari shundan iboratki, oqsilning o'tish holatida hali to'liq shakllangan qismlarida qilingan o'zgarishlar kuzatilgan inaktivatsiya tezligiga kam ta'sir qiladi.Faqat buklangan va o'tish holatida turli tuzilmalarga ega bo'lgan hududlardagi o'zgarishlar kuzatilgan inaktivatsiya tezligiga ta'sir qiladi. Afsuski, barnase uchun mavjud bo'lgan katta ma'lumotlar to'plami yo'qligi sababli, qaysi mintaqalar ochilish yo'lida erta yoki kech bo'lishini oldindan aytish mumkin emas va sinov va xatolik, ehtimol, mavjud bo'lgan eng yaxshi yondashuvdir.

Barnaza kabi oqsillar uchun, hatto eng sekin ochiladigan disulfid mutantining ochilish tezligi konstantasi taxminan 1 mS bo'lsa, bu tahlil foydali funktsiya uchun muhim emas. Biroq, sekin va qaytarib bo'lmaydigan tarzda ochiladigan oqsillar uchun bu printsipni qo'llash muhim ahamiyatga ega. Bacillus lichiniformis dan yuqori termostabil alfa amilaza sekin va qaytmas tarzda ochiladi; karbamid denaturatsiyasi bilan ochilishi yarim soatlik vaqtga ega (S.Miraglia, nashr etilmagan). Mutantlar strukturaning turli qismlarida qurilgan va hatto bir mintaqa atrofida to'plangan keskin mutatsiyalar barqarorlikka juda kam ta'sir qiladi yoki umuman ta'sir qilmaydi (nashr etilmagan A. Day), bu hududlar hali ham ochilish uchun o'tish holatida to'liq shakllanganligini ko'rsatadi.Kimyoviy degradatsiya

Shuni ta'kidlash kerakki, oqsil qat'iylikni barqarorlashtirish orqali qanchalik barqaror bo'lishi mumkin bo'lsa, oqsil barqarorligining yakuniy chegarasi kovalent degradatsiyadan kelib chiqishi kerak. Yuqori haroratlarda (80 - 120 ° C) Asn va Gln deamidlanishga moyil, Asp-Xaa peptid bog'lari gidrolizga moyil, disulfid bog'lari yorilib, Xaa-Pro peptid bog'lari cis-trans izomerizatsiyasiga uchraydi (bu erda Xaa har qanday aminokislotadir. ).
Qizig'i shundaki, protein kimyoviy termostabilligining yuqori chegarasi model mezofil fermentlarni o'z ichiga olgan tadqiqotlarda hisoblanganidan yuqori bo'lishi mumkin. Faqatgina bu qoldiqlardan qochishning ahamiyatsiz javobidan tashqari (giper-termofillarda disulfidlar yo'q va Asn/Gln miqdori kamayadi), Gln va Asn qoldiqlarining deamidlanish tezligi, ehtimol, sterik cheklash tufayli, to'liq buklangan holda kamayishi kuzatiladi. gipertermofil tuzilmalar ( Vielle va Zeikus, 1996 va undagi havolalar).Evolyutsiya va oqsil barqarorligi
Nima uchun oqsillarning ko'pchiligi faqat 5-15 kkal/mol darajasida barqaror? Ehtimol, xuddi shu sababdan, biz tanklarda yurmaymiz. Evolyutsion bosim oqsilning (yoki avtomobilning) o'z vazifasini bajarishi uchun etarlicha kuchli bo'lishidir, lekin kuchliroq emas. Agar oqsil barqarorlashtiruvchi mutatsiyani (boshqa hech qanday ta'siri yo'q) to'plasa, uni barqaror ushlab turish uchun evolyutsion bosimsiz, u tez orada boshqa beqarorlashtiruvchi mutatsiyani to'plashi mumkin. Biroq, agar bu oqsil uning ishlash qobiliyatini buzadigan beqarorlashtiruvchi mutatsiyani to'plasa, tabiiy tanlanish uni tezda yo'q qiladi. Buni ko'rsatadigan misollardan biri, barnazaning binase deb ataladigan yaqin homologga mutatsiyasidir ( Serrano va boshqalar, 1993 ). Ushbu oqsillar 110 ta aminokislotadan 17 ta farqga ega va yuqori darajada supero'tkazuvchi tuzilmalarga ega.Har bir individual mutatsiya barnazadan binazagacha qilingan va bu nuqta mutatsiyalarining har biri faqat +1,1 va -1,1 kkal/mol orasida barqarorlikka ta'sir qilgan. Bu shuni ko'rsatadiki, bir proteindan ikkinchisiga neytral o'tish barqarorlikni sezilarli darajada barqaror ushlab turadi. Bu beqarorlashtiruvchi mutatsiyalar reversiya yoki kompensatsiya yo‘li bilan tanlanadi, barqarorlashtiruvchi mutatsiyalar esa funksiya uchun zarur bo‘lmagani uchun saqlanmaydi, degan gipotezaga mos keladi. Shunisi qiziqki, oltita barqarorlashtiruvchi mutatsiyalar birikmasi yovvoyi turga qaraganda 3,3 kkal/mol barqarorroq bo'lgan oqsilga olib keldi. Shunday qilib, bu holda oqsilning yuqori barqarorlikka erisha olmasligi uchun aprior sabab yo'q.

2.