Mavzu: Oqsillardagi barqarorlik va aylanish

A-kristalin dimerlarini qadoqlash

Bekman-Coulter Porton LF3000G oqsillarni sekvensiya qilish mashinasi
A oqsil sekvenatori avtomatlashtirilgan tarzda Edman degradatsiyasini amalga oshiradigan mashinadir. Protein yoki peptid namunasi oqsil sekvenatorining reaksiya idishida immobilizatsiya qilinadi va Edman degradatsiyasi amalga oshiriladi. Har bir tsikl oqsil yoki peptidlardan bitta aminokislotani chiqaradi va hosil qiladi N-terminus va chiqarilgan aminokislota hosilasi keyinchalik HPLC tomonidan aniqlanadi. Tartiblash jarayoni bir butun uchun takroriy ravishda amalga oshiriladi polipeptid butun o'lchov ketma-ketligi o'rnatilguncha yoki oldindan belgilangan tsikllar soni uchun.
  Asosiy maqolalar: oqsil massasi spektrometriyasi va Peptidlarning ketma-ketligi Oqsillarni identifikatsiyalash - bu aminokislotalar ketma-ketligi asosida, qiziqish bildiradigan oqsilga (POI) ism berish jarayoni. Odatda, oqsilni genlarining DNK sekanslaridan chiqarilgan oqsillar sekanslari ma'lumotlar bazalariga asoslanib aniqlash uchun oqsillar ketma-ketligining faqat bir qismini eksperimental tarzda aniqlash kerak. Keyinchalik oqsillarni tavsiflash POI ning haqiqiy N- va C-terminalarini tasdiqlash, ketma-ketlik variantlarini aniqlash va mavjud bo'lgan har qanday translyatsiyadan keyingi modifikatsiyalarni o'z ichiga olishi mumkin.
Proteinni identifikatsiyalashning umumiy sxemasi tavsiflangan.^[4][5]

1. 
   POI izolyatsiya qilingan, odatda tomonidan SDS-PAGE yoki xromatografiya.
   
2. 
   Sistein qoldiqlarini barqarorlashtirish uchun ajratilgan POI kimyoviy jihatdan o'zgartirilishi mumkin (masalan, S-amidometilatsiya yoki S-karboksimetilatsiya).
   
3. 
   POI peptidlarni hosil qilish uchun o'ziga xos proteaz bilan hazm qilinadi. Tripsin, lizin yoki arginin qoldiqlarining C-terminal tomonida tanlab yorilib, eng ko'p ishlatiladigan proteaz hisoblanadi. Uning afzalliklariga i) oqsillarda Lys va Arg qoldiqlarining chastotasi, ii) fermentning yuqori o'ziga xosligi, iii) fermentning barqarorligi va iv) triptik peptidlarning mass-spektrometriya uchun mosligi kiradi.
   
4. 
   Peptidlar ionlashtiriladigan ifloslantiruvchi moddalarni yo'q qilish uchun tuzsizlantirilishi va ta'sir qilishi mumkin MALDI-TOF mass-spektrometriya. Peptidlarning massasini to'g'ridan-to'g'ri o'lchash oqsilni aniqlash uchun etarli ma'lumotni berishi mumkin (qarang) Peptidning ommaviy barmoq izlari) ammo peptidlarning ketma-ketligi haqida ma'lumot olish uchun ko'pincha mass spektrometr ichidagi peptidlarning keyingi parchalanishidan foydalaniladi. Shu bilan bir qatorda, peptidlarni tuzsizlantirish va ajratish mumkin teskari faza HPLC va an-orqali mass-spektrometrga kiritilgan ESI manba. LC-ESI-MS oqsillarni identifikatsiyalash uchun MALDI-MS ga qaraganda ko'proq ma'lumot berishi mumkin, ammo ko'proq vaqt sarflaydi.
   
5. 
   Mass spektrometr turiga qarab, peptid ionlarining parchalanishi turli xil mexanizmlar orqali sodir bo'lishi mumkin. To'qnashuv natijasida kelib chiqqan dissotsiatsiya (CID) yoki Manbadan keyingi parchalanish (PSD). Har ikkala holatda ham peptidning bo'lak ionlari naqshlari uning ketma-ketligi to'g'risida ma'lumot beradi.
   
6. 
   Bashoratli peptid ionlarining va ularning parchalanadigan ionlarining o'lchangan massasini o'z ichiga olgan ma'lumotlar, keyinchalik kontseptual (silikodagi) proteolizdan olingan oqsillar ketma-ketligi va ma'lumotlar bazalarining parchalanishidan hisoblangan massa qiymatlariga mos keladi. Muvaffaqiyatli o'yin, agar uning natijasi tahlil parametrlari asosida chegara qiymatidan oshsa topiladi. Haqiqiy oqsil ma'lumotlar bazasida namoyish etilmagan bo'lsa ham, xatolarga chidamli moslik oqsilni o'xshashligi asosida taxminiy identifikatsiyalashga imkon beradi. gomologik oqsillar. Ushbu tahlilni amalga oshirish uchun turli xil dasturiy ta'minot to'plamlari mavjud.
   
7. 
   Dasturiy ta'minot to'plamlari odatda har bir aniqlangan oqsilning identifikatsiyasini (qo'shilish kodini), uning mos kelishini ko'rsatadigan hisobotni tuzadi va bir nechta oqsillar aniqlangan joyda mos keladigan kuchning o'lchovini beradi.
   
8. 
   Belgilangan oqsilning ketma-ketligi bo'yicha mos keladigan peptidlarning diagrammasi ko'pincha ketma-ketlikni qoplashni ko'rsatish uchun ishlatiladi (peptid sifatida aniqlangan oqsilning%). POI mos keladigan oqsildan sezilarli darajada kichikroq deb hisoblangan joyda, POI aniqlangan oqsilning N- yoki C-terminal bo'lagi ekanligini taklif qilishi mumkin.
   

Peptidning parchalanish modeli uning ketma-ketligini to'g'ridan-to'g'ri aniqlashga imkon beradi de novo ketma-ketlik. Ushbu ketma-ketlik oqsillar ketma-ketligining ma'lumotlar bazalariga mos kelish yoki tekshirish uchun ishlatilishi mumkin tarjimadan keyingi yoki kimyoviy modifikatsiyalar. Yuqorida aytib o'tilganidek, oqsillarni aniqlash uchun qo'shimcha dalillar keltirishi mumkin.
Proteinni identifikatsiya qilish paytida mos keladigan peptidlar, mos keladigan oqsil uchun bashorat qilingan N- yoki C-terminini o'z ichiga olmaydi. Buning sababi, N- yoki C-terminal peptidlarni MS tomonidan aniqlash qiyin (masalan, juda qisqa yoki juda uzun), translyatsiyadan so'ng o'zgartirilgan (masalan, N-terminalli asetilatsiya) yoki bashoratdan chinakam farq qiladi. Translatsiyadan keyingi modifikatsiyalar yoki qisqartirilgan terminlar ma'lumotlarni batafsil o'rganish orqali aniqlanishi mumkin (ya'ni.) de novo ketma-ketlik). Har xil o'ziga xoslikdagi proteaza yordamida takroriy hazm qilish ham foydali bo'lishi mumkin.
Translatsiyadan keyingi modifikatsiyani aniqlash uchun MS ma'lumotlarini ma'lum oqsillar ketma-ketligiga asoslangan bashoratlar bilan batafsil taqqoslashdan foydalanish mumkin, shuningdek ma'lumotlar yig'ish uchun maqsadli yondashuvlardan foydalanish mumkin. Masalan, fosfopeptidlarning o'ziga xos boyishi aniqlashda yordam berishi mumkin fosforillanish oqsil tarkibidagi joylar. Mass-spektrometrda peptid parchalanishining alternativ usullari, masalan ETD yoki ECD, qo'shimcha ketma-ketlik ma'lumotlarini berishi mumkin.
Proteinning butun massasi uning aminokislota qoldiqlari massasi va suv molekulasi massasining yig'indisidir va har qanday translyatsiyadan keyingi modifikatsiyalar uchun sozlangan. Garchi oqsillar ulardan olingan peptidlarga qaraganda kamroq yaxshi ionlashtirsa-da, eritmadagi oqsil ESI-MS ta'siriga tushishi va uning massasi 20000 dan 1 qismgacha aniqlikda o'lchanishi mumkin. Bu ko'pincha terminini tasdiqlash uchun etarli bo'ladi (shuning uchun oqsilning o'lchangan massasi uning ketma-ketligidan bashorat qilinganiga to'g'ri keladi) va translyatsiyadan keyingi ko'plab modifikatsiyalar mavjudligi yoki yo'qligi haqida xulosa chiqarish.
Proteoliz har doim ham POI ketma-ketligini qamrab oladigan, osonlikcha tahlil qilinadigan peptidlar to'plamini beravermaydi. Mass spektrometrdagi peptidlarning parchalanishi ko'pincha har bir peptid bog'lanishida bo'linishga mos keladigan ionlarni hosil qilmaydi. Shunday qilib, har bir peptid uchun chiqarilgan ketma-ketlik to'liq bo'lishi shart emas. Parchalanishning standart usullari leytsin va izoleysin qoldiqlarini izomerik bo'lgani uchun ajratmaydi.
Edman degradatsiyasi oqsilning N-terminalidan kelib chiqqanligi sababli, agar N-terminusi kimyoviy o'zgartirilgan bo'lsa (masalan, atsetilatsiya yoki Piroglutamik kislota hosil bo'lishi bilan) ishlamaydi. Edman degradatsiyasi odatda disulfid ko'priklarining holatini aniqlash uchun foydali emas. Bundan tashqari, sezgir natijalar uchun 1 pikomol yoki undan yuqori peptid miqdori talab etiladi, bu esa undan kam sezgir bo'ladi mass-spektrometriya.


^ Gundry RL, White MY, Murray CI, Keyn LA, Fu Q, Stanley BA, Van Eyk JE (oktyabr 2009). "Oqsillarni va peptidlarni massa spektrometriyasini tahlil qilish uchun pastdan yuqoriga qarab proteomika ish oqimida tayyorlash". Molekulyar biologiyaning amaldagi protokollari. 10-bob: Birlik10.25. doi:10.1002 / 0471142727.mb1025s88. PMC 2905857. PMID 19816929.
Xulosa va tavsiyalar.
Xulosa qilib shuni aytish mumkunki oqsillar xujayrada boshqa brikmalarga (ximiyaviy komponentlarga) karaganda ancha kup jarayonlarda xilma-xil funktsiyalarni bajaradilar. Xamma proteinlarning struktura elementlari bir xil aminokislotalar dan iborat bulsa xam, ularning oksil molekulasidagi nisbiy mikdorlari va joylashish urinlari turlichadir. Kup minglab oklillarni sistemali va mantikiy klassifikatsiyasi ularning ximiyaviy strukturasiga asoslangan bulishi kerak. Ammo bu klassifikatsiya soddarok printsiplar-ularning funktsiyasi, kelib chikishi, joylanishi, erish xususiyati, sodda yoki murakkabligi asosida tuzilgan. Proteinlar bajaradigan funnktsiyalar fakat oksil molekulalari uchungina xos bulib, aksari takrorlanmasdir. Eng muxim funktsiyalari kuydagilar:
— katalitik funktsiyasi — shu vaktgacha kashf etilgan barcha biologik katalizatorlar - fermentlar oksilardir. Bir xujayrada ularni soni 2000 dan ortik. Katalitik fakat oksilargagina xosdir.
— extiyot ozika moddasi sifatida — oksilar chegaralangan mikdorda konda, ba‘zi, tukimalarda, kup mikdorda usayotgan xomilada, usimliklar donida, tuximdan va sutda bulib, zarur bulgan sharoitda sariflandilar.
— transport funktsiyasi — konda kislorodni tashish funktsiyasini oksil- gemoglobin tomonidan bajariladi. Proteinlar konda lipidlar ba‘zi garmonlar, metal ionlari bilan kompleks xosil kilib ularni tegishli tukimalarga yetkazidilar.
— ximoya funktsiyasi —barcha immun tanalar oksilardir. Ular organizimga kirgan bakteriyani, yot oksilarni yuksak spetsifiklik bilan boglaydilar, parchalaydilar, zararsizlantiradilar.
— kiskarish funktsiyasi muskullarning kiskarishi oksillarning ishtirokida sodir buladi. Ularning eng muximlari aktin va meozin kiskaruvchi muskul tolalarini xosil kiladi. Meozin yana fermentlik faoliyatiga ega.
— oksil garmonlar — barcha ichki sekretsiya bezlarining maxsulotlari peptid va oksil tabiatiga ega masalan: insulin, oshkozon osti bezi garmoni, usish garmoni va boshkalar. Ular organizimni moddalar almashinuvini roslab turadilar.
— struktura funktsiyasi —  oksilar biriktiruvchi tukimalarning asosiy kurilish materialidir: keratin, kologen, elastin anashular jumlasidan lekin oksilar xujayra skleti, xramosomalar, membrana,ribosomalar, retseptorlar tarkibida boshka moddalar bilan katnashadilar. Oksilarni ularni tartibiga karab ikki kategoriyaga bulish mumkin: sodda oksilar-proteinlar va murakab oksilar proteidlar. Birinchi kategoriyaga tegishli oksilar fakat protein molekulasidan iborat bulib, boshka kushimcha komponentlar tutmaydilar. Murakkab oksillar polipeptid zanjiridan tashkari, unga boglangan peptid bulmagan organik yoki onorganik grupasi saklaydilar. Prostetik grupa yunoncha kushimcha demak. Bu komponentning kimyovi tabiatiga karab murakab oksilar kuydagi grupalarga bulinadi: gliko proteidlar, uglevod, metolo proteidlar, metal ioni, gimo proteinlar, gem, flavoproteinlar-flavinlar fosfor proteinlar, fakat kislota koldigi va lipo proteinlar-lipid grupasini tutadi.