Mavzu: Oqsillardagi barqarorlik va aylanish

N- aminokislota terminali tahlili (1-rasm)
 
Sangerning peptid guruhini tahlil qilish usuli: A derivatizatsiya N- bilan terminali tugatish Sanger reaktivi (DNFB), B dinitrofenil peptidning umumiy kislota gidrolizi
Qaysi aminokislota hosil bo'lishini aniqlash N-terminus a peptid zanjir ikki sababga ko'ra foydalidir: peptid bo'laklari ketma-ketligini butun zanjirga tartiblashda yordam berish va birinchi tur Edman degradatsiyasi ko'pincha iflosliklar bilan ifloslangan va shuning uchun aniq aniqlik bermaydi N-terminal aminokislota. Uchun umumlashtirilgan usul N- aminokislota terminali tahlili quyidagicha:

1. 
   Peptidni terminal aminokislotani tanlab belgilaydigan reaktiv bilan reaksiyaga kiriting.
   
2. 
   Oqsilni gidroliz qiling.
   

Aminokislotani xromatografiya va standartlar bilan taqqoslash orqali aniqlang.
Terminal aminokislotalarni belgilash uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan juda ko'p turli xil reagentlar mavjud. Ularning barchasi omin guruhlari bilan reaksiyaga kirishadi va shu sababli lizin kabi aminokislotalarning yon zanjiridagi amin guruhlari bilan ham bog'lanadi - shu sababli to'g'ri joy tanlanganligini ta'minlash uchun xromatogrammalarni izohlashda ehtiyot bo'lish zarur. Eng keng tarqalgan reaktivlardan ikkitasi Sanger reaktivi (1-ftor-2,4-dinitrobenzol) va kabi dansil hosilalari dansil xlorid. Fenilizotiyosiyanat, Edman degradatsiyasi uchun reaktivdan ham foydalanish mumkin. Xuddi shu savollar aminokislota tarkibini aniqlashda bo'lgani kabi amal qiladi, faqat dog 'kerak emas, chunki reaktivlar rangli hosilalarni hosil qiladi va faqat sifatli tahlil talab qilinadi. Shunday qilib, aminokislota faqat standart bilan taqqoslaganda, xromatografiya kolonkasidan chiqarilishi shart emas. Shuni ham hisobga olish kerakki, har qanday omin guruhlari markalash reagenti bilan reaksiyaga kirishganligi sababli, ion almashinadigan xromatografiyadan foydalanish mumkin emas va yupqa qatlamli xromatografiya yoki yuqoribosimli suyuqlik xromatografiyasi o'rniga ishlatilishi kerak.
Mavjud bo'lgan usullarning soni C-terminali aminokislotalar tahlili mavjud bo'lgan N-terminalli tahlil usullaridan ancha kichikdir. Eng keng tarqalgan usul - qo'shish karboksipeptidazalar oqsil eritmasiga, ma'lum vaqt oralig'ida namunalar oling va vaqtga qarab aminokislotalar konsentratsiyasining uchastkasini tahlil qilib, terminal aminokislotani aniqlang. Ushbu usul polipeptidlar va oqsil bloklangan N termini holatida juda foydali bo'ladi. C-terminal sekvensiyasi DNK sekanslaridan bashorat qilingan oqsillarning birlamchi tuzilmalarini tekshirishda va ma'lum bo'lgan kodon sekanslaridan gen mahsulotlarini translyatsiyadan keyingi qayta ishlashini aniqlashda katta yordam beradi.
  Asosiy maqola: Edman degradatsiyasi
The Edman degradatsiyasi oqsillarni ketma-ketligi uchun juda muhim reaktsiya, chunki u oqsilning buyurilgan aminokislota tarkibini topishga imkon beradi. Avtomatlashtirilgan Edman sekvensionlari hozirda keng qo'llanilmoqda va peptidlarni taxminan 50 ta aminokislotalarga qadar ketma-ketlik qilishga qodir. Edman degradatsiyasi bilan oqsilni ketma-ketligi uchun reaktsiya sxemasi quyidagicha; keyinchalik ba'zi qadamlar ishlab chiqilgan.

1. 
   Har qanday sindirish disulfidli ko'priklar a bilan oqsilda kamaytiruvchi vosita kabi 2-merkaptoetanol. A himoya guruhi kabi yod sirka kislotasi aloqalarning qayta shakllanishiga yo'l qo'ymaslik uchun kerak bo'lishi mumkin.
   
2. 
   Agar bir nechta bo'lsa, oqsil kompleksining alohida zanjirlarini ajratib oling va tozalang.
   
3. 
   Har bir zanjirning aminokislota tarkibini aniqlang.
   
4. 
   Har bir zanjirning terminal aminokislotalarini aniqlang.
   
5. 
   Har bir zanjirni 50 ta aminokislota ostida bo'laklarga bo'ling.
   
6. 
   Parchalarni ajratib oling va tozalang.
   
7. 
   Har bir fragmentning ketma-ketligini aniqlang.
   
8. 
   Boshqa dekolte naqshini takrorlang.
   
9. 
   Umumiy oqsilning ketma-ketligini tuzing.
   

Taxminan 50-70 aminokislotadan uzunroq bo'lgan peptidlarni Edman degradatsiyasi bilan ishonchli ravishda ketma-ket qilib bo'lmaydi. Shu sababli, uzun protein zanjirlarini kichik bo'laklarga ajratish kerak, keyinchalik ularni alohida-alohida tartiblash mumkin. Ovqat hazm qilish ham tomonidan amalga oshiriladi endopeptidazlar kabi tripsin yoki pepsin yoki kabi kimyoviy reagentlar tomonidan amalga oshiriladi siyanogen bromid. Turli xil fermentlar turli xil dekolte naqshlarini beradi va parchalar orasidagi ustma-ust umumiy ketma-ketlikni yaratish uchun foydalanish mumkin.
Tartibga solinadigan peptid bu adsorbsiyalangan qattiq yuzaga Umumiy substrat bilan qoplangan shisha tola polibren, a katyonik polimer. Edman reaktivi, fenilizotiyosiyanat (PITC), adsorbsiyalangan peptidga yumshoq asos bilan qo'shiladi buferli eritma 12% dan trimetilamin. Bu N-terminal aminokislotaning amin guruhi bilan reaksiyaga kirishadi.
Keyin terminal aminokislota qo'shilishi bilan tanlab ajratilishi mumkin suvsiz kislota. Keyin lotin izomeriyalar almashtirishni berish feniltiyohidantoin, uni yuvish va xromatografiya yordamida aniqlash va tsiklni takrorlash mumkin. Har bir qadamning samaradorligi taxminan 98% ni tashkil etadi, bu taxminan 50 ta aminokislotani ishonchli aniqlashga imkon beradi.

3.