O`zbekiston respublikasi oliy va o`rta maxsus ta'lim vazirligi

5.5. Ikkiyoqlama immunodiffuziya reaksiyasi (IID).

Ishdan maksad. IID -usulini o`rganish va u yordamida har xil obyektlardan

olingan namunalarda virus borligini, serologiya jihatidan har xil virus 
shtammlarining yaqin qarindoshligini, qisman qarindoshligini, o`xshashligini,
umuman o`xshash emasligini reaksiyada hosil bo`lgan pretsipitatsiya chiziqlariga 
qarab Aniqlash usullari bilan tanishish.
Materiallar va qurollar. 

Reaktivlar: usulni ishlatish uchun maxsus olingan A3, agar - agar ("Difko"

agari) yoki agaroza (agar - agarning neytral qismi, maxsus usul bilan zaryadli
guruhli agaro - pektindan tozalangan), agar -agarni eritish uchun har xil 
eritmalar: 0,07 M fosfat buferiga 0,15 M NaCl solingan rN 7,2 bo`lgan eritma (9
qism 0,15 M NaCl va 1 qism 0,07 M) fosfat buferi. Fosfat buferini tayyorlash: 
KN
2

RO

4
-9,073 gG`l; Na
2
PO

4

-2H
2
O-11,87 gG`l: 29,6 ml KN

2
RO

4

eritmasini

100 gacha Na
2
HPO

4
eritmasi bilan olib boriladi. Natijada rN 7,2 ga teng 0,07 M 

fosfat buferi xosil bo`ladi, amid, metanol, sirka kislotasi, vazelin.
Uskunalar: agar - agar gelida chuqurcha hosil un ishlatiladigan maxsus 

shtamp (qoliplar), vakuum nasosi "shayton", agar -agar quyish stolchasi.

Ishning borishi. Bir protsentli "Difko" agari eritmasini virus uchun optimal 

hisoblangan buferda (TMV uchun ,05 M fosfat yoki 0,05 M tris-HCl buferi

hisoblanadi) tayyorlanadi. Antiseptik sifatida mertiolat yoki natriy azidini ishlatish 
mumkin. Ba'zi bir uzunchoq viruslarni (masalan: jo`xorining pakana mozaikasi,
sholg`om mozaikasi viruslarini) aniqlaganda 0,1% natriy dodetsil sulfat solinadi. 
Shu reaktivlar solib tayyorlangan agar -agarni suv hammomida eriguncha
qaynatiladi. So`ngra 25 ml o`lchab oli - nadi va shayton bilan gorizontal qilib 
urnatilgan oyna plastinka ustiga (9x12 sm) oxistalik bilan quyiladi va sovub
qottuncha va parlanishni kamaytirish maqsadlarida qopqoq bilan yopiladi. Qotib 
gel holiga kelgan agar - agarning qalinligi 3 mmga yaqin bo`ladi. So`ngra maxsus
shtamplar yordamida 2 mm diametrlik va chuqurchalar orasidagi masofa 6 mm 
bo`lgan chuqurchalar qilinadi. Chuqurchalardan agar -agar parchalarini vakuum
nasos yordamida tortib olinadi. Plastinkaning chetki qismlarida agar -agar gelining 
namligini ma'lum darajada saqlash maqsadida maxsus 6 mm diametrlik

---

---

27

chuk.urchalar kilinadi va ularga bufer bilan tulgaziladi. AG (10a -rasm) va A3 (9 - 
rasm) lar solish uchun chuqurchalar yoki "yulduzcha" shaklida yoki ikki qator qilib
tayyorlanadi. Reaksiya "yulduzcha" shaklida qilingan chuqurchalarda olib borilsa, 
markazdagi chuqurchaga AG solinadi va atrofidagi chuqurchalarga esa A3 ning
har xil suyultirilgan eritmalari solib to`latiladi. Reaksiya ikki qator qilib 
tayyorlangan chuqurchalarda olib borilsa, ustki qatordagi chuqurchalarga AG (yoki
AT lar) solinadi. A3 ning titri baland bo`lsa u bir necha marta suyultiriladi. 
Suyultirish uchun odatda 0,85% lik osh tuzi eritmasi ishlatiladi.
Chuqurchalar maxsus AG va A3 lar bilan to`latilgandan so`ng 48 soatga 

nam kameraga qo`yiladi. Kamera sifatida eksikator ishlatish mumkin. Uning tagiga

5 - 7 sm vodoprovod suvidan solinadi va qopqoq chetlari vazelin bilan moylanadi. 
Shunday qilib tayyorlangan nam kameraga reaksiya qo`yilgan shishani maxsus
ko`targichga joylashtirgan xolda o`rnatiladi, nam kamera qopqoq bilan yopilib 48 
soatga xona haroratida saqlanadi. Bu vaqt ichida virus (AG) va AT lar agar - agar
gelining teshikchalari orqali har tomonga tarqaladilar (1% li agar -agar gelining 
teshiklari radiusi 120 nm atrofida bo`ladi) va uchrashgan joylarida AG va AT
biospetsifik ravishda bog`lanadilar. Bunday bog`langan molekulalarning miqdori 
shunchalik ko`pligidan ular kuzga yaxshi ko`rinadigan xira oqish rangda
pretsipitatsiya liniyalarini hosil qiladi (tashki ko`rinishidan xuddi 3 - 5 kunlik 
oysimon ko`rinishda bo`ladi). Pretsipitatsiya chizigining qalin yoki ingichkaligi
AG va AT ning konsentrasiyalariga qarab har xil qalinlikda bo`ladi. (12 -rasm) 
Amaliyotda ularning qalinlik darajalarini ko`rsatish uchun 4 ballik sistemadan
foydalaniladi: eng qalin pretsipitatsiya chizig`i 4 ta musbat belgisi bilan belgilanadi 
(++++), undan ingichkarog`i "+++", "++", "+", "-" qilib belgilanadilar. Manfiy "-"
belgisi reaksiyani yo`qligini ko`rsatadi. 
IID - usuli yordamida ikki yoki bir nechta virus AG |larining bir -biriga to`la 

o`xshashligini qisman o`xshashligini, ham aniqlash mumkin. Buning uchun

quyiladigan reaktsiya avvaldan shu maqsad uchun moslab qo`yiladi. Reaksiya agar 
liniya xolda qo`yilsa tepa (birinchi) qatorga 2 yoki bir [nechta antigenlar yonma -
yon chuqurchalarga quyiladi, tagidagi (ikkinchi) qatordan qarama - qarshi 
chuqurchalarga esa AG larning faqat bittasining A3 si solinadi. Pretsipitatsiya
chiziqlari xosil bo`lgandan so`ng shu chiziqlarning ko`rinishiga qarab AG larning 
bir -biriga munosabatlari aniqlanadi. Ikki AG orasidagi pretsipitatsiya chizig`i bir
chiziq bo`lib qo`shilib ketsa -AG lar bir-biri bilan o`xshash hisoblanadi: 
pretsipitatsiya chiziqlari qo`shilsa -yu, lekin qo`shilgan yerida bir - birini kesib
o`tib ketsa -AG lar to`la (butunlay) o`xshash emas deyiladi. Masalan, bir virusning 
ikki shtammi pomidordagi TMV va tamakidagi TMV shtammlari ko`p
o`simliklarda har xil alomatlar hosil qilsalar ham AG jihatidan ular to`la bir -birlari 
bilan o`xshashdirlar: shu pomidordagi TMV tamakini TMV virusining Qozoq
shtammi bilan qisman o`xshashdir va hokazo (12-raem). 
Reaksiya natijalari maxsus kundalik daftarga belgi - lab quyilgandaya so`ng, 

sur'atga olish mumkin, natijalarini uzoq muddatga saqlamokchi bo`linsa ikki xil

usul qo`llaniladi. 
1. Reaksiya natijalarini tug`ridan to`g`ri suratga olinadi.
2. Shisha plastinka ustidagi bizni qiziqtirgan reaktsiya natijalari oxistalik bilan 
o`tkir tig` yordamida kesib olinadi (shartli belgi qo`yish mqsadga muvofiq
bo`ladi). 

---

---

28

12 -rasm. Ikki yoqlama immunodiffuziya reaksiyasi. A- KXV bilan uning A3 si 

orasidagi pretsipitatsiya reaksiyalari. 1,2 chuqurchalar A3 bilan, 3,9,12, 16,26

chuqurchalar KXV bilan to`ldirilgan. B. Arpaning chiziqli mozaika virusi bilan 
uning A3 si orasidagi pretsipitatsiya reaksiyasi. 1 - 2 chuqurchalar ACHMV A3 si,
3 - 20 chuqurchalar ACHMV bilan to`ldirilgan. 

13 - rasm. Immunodiffuziya tajribalaridagi pretsipitatsiya chiziklarining 

(PCh) joylashish (hosil bo`lishi) tiplari.
I. O`xshashlik (bir xillik, yaqinlik reaktsiyasi (реакция идентичности) - ikki virus 
(shtamm) A3 bilan hosil qilgan PCh larining I qushilib ketishi, ya'ni V va J
shtammlarning antigenlari serologiya I tomonidan o`xshash (identichnost). 
P. Antizardob geterologik antigen bilan reaksiyaga kirmaydi, S antigeni A3 -0
antizardobi (A3) bilan reaksiyaga kirmaydi, PCH hosil qilmaydi, O antigeni 
gomologik A3 (As -0) bilan PCH hosil qiladi.
III. Qisman o`xshashlik reaksiyasi (реакция частичной идентичности): PCH 
lari qisman kesishadi va shpora hosil qiladi. Bu tipdagi PCH shuni ko’rsatadiki, V-
A3 dagi hamma AT xam S -antiteni bilan PCH hosil qlavermaydi; S - antigen bilan 
boгlanmaganlari PCH dan diffuziya bo`lib o’tib, V -antigeni bilan reaksiyaga kirib
shpora hosil qiladi. 
IV. To`la o`xshamaslik reaktiyasi (реакция полной идентичности): ikki
yoqlama shpora hosil buladi. BFV va 
3. U2 As -V A3 tarkibidagi ma'lum mikdor AT bilan PCH hosil qiladi va har bir
shtamm ikkinchi shtamm munosabatida bo’lmaydigan I AT bilan PCH hosil qiladi. 
Belgilar har xil bulishi mumkin. Masalan, to’g’ri to’rt burchak qilib 

---

---

29

reaksiyalik agar- agar gelining yuqori ung burchagidan 2 - 3 mm2 qilib tig` uchi 
bilan kesib olib tashlanadi, ikkinchi yulduzchadagi reaksiyami boshqa burchagida
shunga o`xshamagan belgi qilinadi va kundalik daftarga belgilab qo`yiladi, 
Belgilash ishlari tugaganidan sung 0,85% lik osh tuzi eritmasiga 2 - 5 soatga solib
qo`yiladi. Bu vaqt ichida reaksiyaga qatnashmagan A3 oqsillari, AG ning 
tarkibidagi oqsil, pigment, taninsimon moddalari va hokozolar geldan yuvilib
chiqadi, aks holda bo`lar ham pretsipitatsiya chiziqlari bilan birga amid qora rang 
bilan bo`yaladi va reaktsiya natijalarini kuzatishni qiyinlashtiradi. So`ngra agar -
agar gelini oxistalik bilan buyum oynasiga o`tkaziladi (buyum oynalari yaxshilab 
xrom aralashmasi bilan yuvilib etanolda yopiq holatda saqlanadi, aks holda unga
quyilgan agar -agar kuchib ketishi mumkin) va uning ustiga xromatografiyada 
ishlatiladigan qog`oz yoki filtr qog`ozi bo`lakchasi bilan yopiladi va kuritish uchun
24 soatga quyiladi yoki ventilyator yordamida 2 - 3 soat davomida quritiladi. 
So`ngra oqib turgan suvga tutib turib filtr qog`ozi va uning mayda bo`laklaridan
tozalanadi. Keyingi qilinadigan ish -reaksiya natijalarini bo`yashdir. Bo`uyoq 
sifatida 0,3% li amidoshvarts (qora amid) bo`yog`i ishlatiladi. Bo`yoq erituvchisi
qilib metanol, konsentrlangan sirka kislotasi va suvni 4:4; 1 nisbatda aralashtirilib 
0,3% qora amidni eritiladi. Bo`yalgan preparatni bo`yoqni ortiqchasidan yuvish
uchun yuqoridagi erituvchining o`zi qora amidsiz holda ishlatiladi. Bo`yash 10 
minut davom etadi, so`ngra bo`yalgan preparat yuvilishga qo`yiladi. Vaqti - vaqti
bilan yuvuvchi eritma sutka davomida 3 - 4 marta almashtirilib turiladi. Shu usul 
yordamida reaksiya natijalari yana bir marta kuzatiladi, hisobga olinadi, suratga
olinadi va uzoq muddatta saqlanishi mumkin. 
Adabiyotlar: 

1. Зильбер Л.А., Абелев Г.И. Вирусология и иммунология рака М.: 1962. 458 

с.
2. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул 

электрофокусированием,

иммуноэлектрофсрезом 
и
радиоизотопными 

методами. Изд-во Наука, М, 6 1983, С. 124-127.

3. Бем Э. Иммунодифузия. Иммунологические методы Изд-во Медицина М.: 
1987. С. 73-88

http://hozir.org