Pzr uchun ishchi aralashma (master mix ) tayyorlash va termotsikler (pzr) bilan ishlashni o'rganish. Reaksiya qo'yish

PZR uchun ishchi aralashma (master mix) tayyorlash va termotsikler (PZR) bilan ishlashni o’rganish. Reaksiya qo’yish.

Polimeraza zanjir reaksiyasi yoki PZR bu maʼlum DNK boʻlagini in vitro (odam organizmida emas, tajriba probirkasida) koʻp marta nusxalash usuli hisoblanadi.

PZR termostabil DNK polimerazaga, Taq polimerazaga, bogʻliq va DNKning shu qismi uchun maxsus DNK praymerlari boʻlishini talab qiladi.
PZRda harorat oʻzgarishi bilan reaksiya bir necha marta takrorlanadi, shu orqali DNK nishon qismining koʻplab nusxalarini olish mumkin.
PZR ustida koʻplab tajribalar va amaliy dasturlar olib borilgan. Bundan asosan DNKni klonlash, tibbiy diagnostika va sud-tibbiy ekspertizasida foydalaniladi.
PZR nima?
Polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR) bu DNK maʼlum qismining koʻplab marotaba (million yoki milliard) nusxasini olish uchun qoʻllanadigan, keng tarqalgan laborator usul hisoblanadi. Bu DNK qismi tajriba oʻtkazuvchini qiziqtirgan har qanday soha boʻlishi mumkin. Misol uchun, bu tadqiqotchi funksiyasini aniqlashni maqsad qilgan gen yoki sud-tibbiy ekspertizasida jinoyatni ochish uchun qoʻllanadigan genetik ashyoviy dalil boʻlishi ham mumkin.
Odatda PZRning maqsadi DNKning kerakli qismini tahlil qilish yoki boshqa maqsadlar uchun yetarli darajada hosil qilishdir. Misol uchun, PZR orqali koʻpaytirilgan DNK keyingi tajribalar, masalan, ketma-ketlikni aniqlash, gel elektroforez yoki klonlash uchun yuborilishi mumkin.
PZR biologiya va tibbiyotning koʻplab sohalari, xususan, molekulyar biologiya, tibbiy tashxislash va hatto ekologiyaning ayrim sohalarida ham qoʻllanadi.
Taq polimeraza
Organizm hujayrasidagi DNK replikatsiyasi kabi, PZR jarayonida ham yangi DNK zanjirlarini hosil qilish uchun andoza DNK va DNK polimerazalarning boʻlishi talab etiladi. PZRda odatda Taq polimeraza deb nomlangan DNK polimerazasi qoʻllanadi, bu issiqlikka chidamli bakteriyalardan (Thermus aquaticus) ajratib olinadi.
T. aquaticus issiq buloqlar va gidrotermal tuynuklarda yashaydi. Uning DNK polimerazasi issiqlikka juda chidamli va 70°C70°C70, °, start text, C, end text (bu haroratda odam yoki E. coli DNK polimerazasi nofunksional holatda boʻladi) atrofida eng faol holatda boʻladi. Bu haroratga chidamli Taq polimeraza PZR uchun juda mos keladi. Koʻrib turganimizdek, PZRda yuqori harorat andoza DNKni denaturatsiyalash yoki uning zanjirlarini ajratish uchun takroriy ravishda qoʻllanadi.
PZR praymerlar
Boshqa DNK polimerazalar singari Taq polimeraza ham faqatgina qisqa nukleotidlar ketma-ketligi, yaʼni praymerlar mavjud boʻlgandagina DNK sintezini boshlashi mumkin. PZR reaksiyalarida tajriba oʻtkazuvchi praymer yordamida nusxasi olinishi yoki koʻpaytirilishi kerak boʻlgan DNK qismini belgilaydi.
PZR praymerlari qisqa bir zanjirli DNK boʻlaklari boʻlib, odatda 202020 ta nukleotiddan iborat. Har bir PZR reaksiyasida ikkita praymer ishlatiladi va ular nishon (nusxalanishi kerak boʻlgan) qismga yon tomonlaridan birikishga moslashtirilgan. Bunda praymerlar ketma-ketligi andoza DNKning qarama-qarshi zanjiriga, yaʼni nusxasi yaratilishi kerak boʻlgan qismning chetki uchi (qirrasi)ga bogʻlanadi. Praymerlar andozaga komplimentar asos juftlashuvi orqali bogʻlanadi.

Andoza DNK:
5ʼTATSAGATSSATGGAGT...GAGTASTAGTSSTATGAGT 5ʼ 3ʼ ATAGTSTAGGTASSTSA...STSATGATSAGGATASTSA 5'
Praymer 1: 5ʼSAGATSSATGG 5ʼ Praymer 2:
Praymerlar andozaga bogʻlangach, ular polimerazalar tomonidan uzaytiriladi va ularning oʻrtasida joylashgan qismning nusxasi yaratiladi.
PZR bosqichlari[DNK
PZR reaksiyasining asosiy tarkibiy qismlari Taq polimeraza, praymerlar, andoza DNK va nukleotidlar (DNK qurilish birliklari)dir. Ferment uchun zarur boʻlgan kofaktorlar bilan birga yuqoridagilar bitta probirkaga yigʻiladi, keyin yuqori va past harorat almashinib turuvchi takroriy siklga qoʻyiladi, natijada DNK sintezlanadi.
Asosiy bosqichlar:Denaturatsiya (96°C96°C96, °, start text, C, end text): DNK zanjirlarini denaturatsiya qilish yoki ajratish uchun reaksiyaga yuqori harorat beriladi. Natijada keyingi bosqich uchun kerakli bir zanjirli andoza hosil boʻladi.
Yumshatish (555555 - 656565°C°C°, start text, C, end text): praymerlar andoza DNKdagi komplimentar qismlariga bogʻlanishi uchun reaksiyada harorat pasaytiriladi.
Uzaytirish (72°C72°C72, °, start text, C, end text): Taq polimeraza praymerlarni uzaytirib, yangi DNK zanjirlarini sintezlashi uchun reaksiyada harorat koʻtariladi.
Bu sikl oddiy PZR reaksiyasida 252525 - 353535 marta takrorlanadi, umumiy hisobda DNKning koʻpaytiriladigan qismiga bogʻliq ravishda 222 - 444 soat vaqt sarflanadi. Agar reaksiya samarali (yaxshi natijali) boʻlsa, nishon qism bir nechtadan milliard marotabagacha koʻpayishi mumkin.
Chunki har reaksiyada faqat boshlangʻich DNK andoza sifatida xizmat qilmaydi, balki bitta reaksiyada yangi sintezlangan DNK ham keyingi reaksiyada andozaga aylanadi. Reaksiyada praymerlar va Taq polimeraza molekulalari juda koʻp miqdorda boʻladi, shu tufayli DNK molekulalari soni har reaksiya siklida ikki barobarga ortishi mumkin. Bunday eksponensial oʻsish darajasi quyidagi rasmda tasvirlangan.

PZR natijalarini vizual tekshirish uchun gel elektroforezdan foydalaniladi
PZR reaksiyasi natijalari odatda gel elektroforez usuli yordamida vizual (koʻz bilan koʻriladigan) tahlil qilinadi. Gel elektroforez – bu DNK fragmentlarini elektr toki yordamida gel matritsasi orqali oʻtkazib, ularni hajmiga koʻra ajratadigan usul. Odatda PZR namunasidagi boʻlaklarning oʻlchamlarini aniqlash uchun standart yoki DNK chizgʻichlari kiritiladi.
Bir xil uzunlikka ega boʻlgan DNK fragmentlari gelda “tasma” hosil qiladi va gel DNK bogʻlovchi boʻyoq bilan boʻyalgan boʻlsa, oddiy koʻz bilan koʻrish mumkin. Misol uchun, 400400400 asos jufti (aj) hosil boʻladigan PZR reaksiyasi gelda quyidagicha koʻrinishda boʻladi:

Chap tomon: 100, 200, 300, 400, 500 aj tasmali DNK chizgʻichi.
Oʻng tomon: PZR reaksiyasi natijasi, 400 aj tasma.
DNK tasmasi DNK nishon qismining bitta yoki bir nechta nusxasini emas, balki juda koʻplab nusxasini oʻz ichiga oladi. DNK mikroskopik oʻlchamda boʻlgani sababli koʻz bilan koʻrish uchun juda koʻp nusxalar bir joyga yigʻilishi kerak.