Pzr uchun ishchi aralashma (master mix ) tayyorlash va termotsikler (pzr) bilan ishlashni o'rganish. Reaksiya qo'yish

3 probirka uchun

-10x lik bufer - 2 mkl
- Bam H1 restriktaza – 0.5 mkl
- Nrul restriktaza – 0.5 mkl (Bu restriktaza DNK ni to’mtoq uch hosil qilib kesadi)
-Bizga kerakli gen saqlagan DNK molekulasi
11. 4 probirka uchun
-10x lik bufer - 2 mkl
- Sak 1 restriktaza- 0.5 mkl (Bu restriktaza DNK ni yopishqoq uch hosil qilib kesadi)
- Nrul restriktaza – 0.5 mkl
-Topo XL vektor plazmidi- 7 mkl
Bu yerda fosforli plazmid 2 xil 1 va 4 probirkadagi fermentlar yordamida kesilyapti.

3. 
   Ish tugagach, short qilinadi (1-rasm).
   
4. 
   So’ng 37⁰ C ga 3 soat termotsiklerga qo’yamiz.
   
5. 
   PZR apparatida kesish boshlanadi.
   
6. 
   Vaqt tugagach, termotsiklerdan olib, 1% li agaroza gelida elektroforezga qo’yiladi.
   
7. 
   Gelda ko’rib, kerakli joy kesib olinadi. Markerga qarab o’lchami orqali aniqlanadi.
   
8. 
   Kesib olingan DNK bo’lagi Konbo kit yordamida geldan tozalanadi.
   
9. 
   Ligaza reaktsiyasi
   

-Ligaza- 1 mkl
-10x lik bufer - 2 mkl
-1 probirkadan- 2 mkl
-2 probirkadan- 2 mkl
- Jami – 7 mkl bo’ldi
16⁰ S da overuight- 16 soat turadi


Poliakrilamid va agaroza gellarini tayyorlash.
Agaroz va poliakrilamid ikkalasi ham suvda eriydigan polimerlardir, lekin ularning kelib chiqishidan boshlab ko'p farqlarni ko'rish mumkin. Agarozada ham, poliakrilamidda ham g'ovakli jel matritsalarini hosil qilishda umumiy narsa bor. Shunga qaramay, ular o'rtasida bir qator aniq farqlar mavjud. Bu ikkala polimer o'rtasidagi asosiy farqlar ularning kelib chiqish tabiatida, kimyoviy tuzilishida, har xil ishlatilishida va jel elektroforezida ishlashida yotadi.Agaroz - tabiiy ravishda paydo bo'ladigan chiziqli polimer, u o'z navbatida dengiz o'tlarida topilgan agar deb nomlangan murakkab polimerdan olingan . Agaroz, agaropektin deb ataladigan oqsil komponentini olib tashlash orqali agardan olinadi . Agaroz - agarga jel hosil qilish qobiliyatini beradigan narsa.
Agarozaning asosiy ishlatilishi mikrobiologik va molekulyar biologik tadqiqotlardir. Mikrobiologik tadqiqotlarda, agaroz, tegishli oziq moddalar bilan to'ldirilsa, bakteriyalar va zamburug'lar kabi mikroorganizmlarni etishtirish uchun mustahkam asos yaratadi. Yarim qattiq konsentratsiyalarda ishlatilganda, bu mikroorganizmlarning harakatchanligini baholashda foydali bo'lishi mumkin. Molekulyar biologiyada u " gel elektroforez " yoki " agarozelli elektroforez " (AGE) deb ataladigan eng asosiy hal qilish jarayonlaridan biri uchun muhim vosita bo'lib xizmat qiladi. Jel elektroforezi - bu nuklein kislotalari yoki oqsillarni o'lchamlari va zaryadlariga qarab ajratish yoki ajratish imkonini beradigan jarayon. Bu erda agaroz, elakka o'xshash gözenekli jel bo'lib xizmat qiladi, bu orqali ajralish sodir bo'ladi.

Agaroz tuzilishi