A gyógyszerhatás fizikai-kémiai alapjai Rozmer Zsuzsanna – Perjési Pál

10.4A megoszlási hányados meghatározásának módszerei

A megoszlási hányados meghatározására alkalmas módszerek két nagy csoportját alkotják az (a) direkt meghatározási módszerek, valamint a (b) indirekt, kromatográfiás módszerek (X-3 táblázat). E mellett léteznek predikciós módszerek, melyek segítségével a vegyületek megoszlási hányadosa számítással becsülhető.
X- táblázat: logP meghatározására használt módszerek.

Módszer	Anyagigény (mg)	Mérési tartomány (logP)	Módszer típusa	Kapacitás (vegyület/nap)
Direkt rázótölcséres 96 lyukú mikrolemez potenciometriás	10-50 1-5 5-10	-2 - +3 -2 - +4 -2 - +6	nem HT HT nem HT	2 100 20
Indirekt RP-TLC RP-HPLC – normál RP-HPLC – HT módon mikroemulziós elektrokinetikus krom.	1-3 1 0,01 1	0 - +5 -1 - +6 -1 - +6 -1 - +6	nem HT nem HT HT HT	50 120 100 120

10.4.1Direkt meghatározási módszerek

Hagyományos rázótölcséres technika
A megoszlási hányados meghatározásának hagyományos módszere az ún. rázótölcséres eljárás. A módszer lényege, hogy két egymással nem elegyedő oldószer között a vizsgálandó anyagot megosztjuk.

A mérés során a vizes és a vele nem elegyedő szerves fázist (leggyakrabban oktanolt) a meghatározást megelőzően egymással telítik, annak érdekében, hogy az egymásban való oldódás ne okozzon hibát a meghatározás során. A vizsgálandó anyagot a vizes fázisban oldják, meghatározzák a koncentrációját, majd hozzáadják a megosztó, szerves fázist. A két fázist a megoszlási egyensúly eléréséig érintkeztetik. A fázisok érintkeztetésére különféle technikai megoldások léteznek. A "shake-flask" módszer során a mintát tartalmazó megfelelő térfogatú, csiszolt dugóval záródó üvegedényt változtatható rázási amplitúdójú és sebességű, termosztálható rázógépbe helyezik; a "stir-flask" módszer egy keverőedényes eljárás, ahol a fázisérintkeztetést megfelelő sebességű felső keverő biztosítja.

A megoszlási egyensúly beállta után a fázisokat centrifugálással szétválasztják és azokban a megoszlott anyag koncentrációját arra alkalmas kvantitatív analitikai módszerrel meghatározzák. A koncentráció meghatározása, amennyiben a vizsgálandó anyag spektrális tulajdonságai azt lehetővé teszik, leggyakrabban UV/VIS spektrofotometriás módszerrel történik.

A reprodukálható eredmények eléréséhez az alábbi kísérleti feltételek rögzítése szükséges: (a) a megosztó fázisok egymással történő előzetes érintkeztetésének ideje, (b) az érintkeztetés hőmérséklete, (c) az egyensúly beállásának ellenőrzése, és (d) az állandó ionerősség biztosítása.

Validált körülmények között végezve a meghatározást, az átlagos hiba -2 és +3 logP tartományban ±0,05-0,10 log egység között mozog. Azoknak a vegyületeknek a megoszlási hányadosát, amelyek logP értéke nagyobb, mint +4, vagy kisebb, mint -2, rázótölcséres módszerrel nem lehet kielégítő pontossággal meghatározni. Ennek oka, hogy a túl lipofil vagy hidrofil molekulák az egyik megosztó fázisban való nagyon kicsi oldhatósága miatt extrém fázisarányt kell alkalmazni, amely megnöveli a mérési hibát.

A direkt eljárások közül a rázótölcséres módszert tekintették sokáig referencia eljárásnak, de ismert korlátai miatt (nagy munka- és időigény, a termosztálás nehezen oldható meg, viszonylag szűk logP tartományban alkalmazható, lipofil molekulák nem mérhetők, nagymennyiségű és nagytisztaságú oldószert igényel stb.) számos más meghatározási módszert dolgoztak ki.

Kétfázisú potenciometriás titrálás
A módszer elve, hogy azonos körülmények között két potenciometriás titrálást végeznek. Az elsőt vizes közegben, a megosztó fázis nélkül, a másodikat pedig a megosztó szerves fázis (pl. oktanol) jelenlétében. Amennyiben a vizsgált vegyület valamely részecskéje megoszlik a két fázis között, úgy a két potenciometriás titrálási görbe nem esik egybe, és a két görbe eltéréséből a logP számítható.

A két potenciometriás titrálás két disszociációs állandó értéket eredményez, a pK_a értéket és p_oK_a értéket, amely a szerves fázis jelenlétében végzett titrálásból származó látszólagos disszociációs állandó. A két érték különbségéből a megoszlási hányados számítható:

Savak esetében:



Bázisok esetében:


ahol R a vizes és a szerves fázis térfogatának hányadosa, vagyis a fázisarány.
Az eljárás megbízható, pontos, elsőszámú validáló módszernek tekinthető ionizálható molekulák esetén és általában olyan vegyületek logP értékének meghatározására alkalmas, melyek logP értéke -1 és +6 közé esik. A módszer hátránya, hogy problematikus az igen lipofil és még inkább a nagyon hidrofil vegyületek logP értékének meghatározása esetén, és teljesítményében egyelőre elmarad az indirekt, kromatográfiás technikák kapacitásától.

10.4.2Indirekt meghatározási módszerek

Az indirekt, más néven alternatív meghatározási módszerek jelenleg a leggyakrabban alkalmazott eljárások a lipofilitás meghatározására. A kromatográfiás módszerek elsősorban akkor használatosak, ha a direkt logP meghatározási módszerek valamilyen okból kifolyólag nem alkalmazhatók. Az indirekt eljárások előnye, hogy az igen nagy és nagyon kis lipofilitású vegyületek is mérhetők, a módszerek gyorsak és egyszerűek, ami nagyon fontos szempont a gyógyszerkutatás korai fázisában.

A kromatográfiás vizsgálatoknál alapvető olyan kromatográfiás rendszer felállítása, ahol a vegyületek retenciója nagy pontossággal megállapítható, ugyanakkor az adott kromatográfiás állófázissal minél hitelesebben lehessen karakterizálni a membrán kettősréteget.

A kromatográfiás módszerek közül a vékonyréteg-kromatográfiás, valamint a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás eljárások a leginkább elterjedtek.
Vékonyréteg-kromatográfiás módszer
A fordított fázisú vékonyréteg kromatográfiás (RP-TLC) módszerek manapság is kiterjedten alkalmazott eljárások a gyógyszermolekulák lipofilitásának jellemzésére, ennek hátterében az áll, hogy a módszer egyszerű, gyors, kis idő alatt egyszerre több vegyület is vizsgálható. A módszer lényege, hogy az eljárás során a lipofilitástól függő kromatográfiás paramétert határozzuk meg, majd kalibrációs egyenes felhasználásával logP értéket számolunk.

A logP meghatározás elvi alapját a folyadék/folyadék megoszláson alapuló kromatográfiás retenció és a megoszlási hányados között fennálló összefüggés adja meg. A retenciós faktorral közvetlenül összefüggésben áll az ún. R_M érték:

ahol, mivel R_f 0 és 1 közötti érték, R_M (az ebből származtatott függvénykapcsolat) +∞-tól -∞-ig változik; V_S az állófázis, V_M a mozgófázis térfogata (V_S/V_M = fázisarány, az adott kromatográfiás rendszerre jellemző állandó), K_VRK a kromatográfiás megoszlási hányados.

Az R_f értékek alapján számított R_M értékek pedig lineáris összefüggésben állnak a logP értékekkel:

A kromatográfiás logP meghatározás lényege tehát, hogy egy kiválasztott standard anyagsorozat esetén, melynek oktanol/víz logP értéke ismert, meg kell határozni az aktuális kromatográfiás rendszerben érvényes R_M értékeket, amely értékeket felhasználva a fenti egyenlet állandói megismerhetők. Ennek alapján egyéb vegyületek logP értéke számítható.

A vékonyréteg-kromatográfiás módszer lehetőséget nyújt lipofil, UV inaktív és ionizációs csoportot nem tartalmazó vegyületek logP értékének meghatározására. Ugyanakkor a minta esetleges szennyezettsége sem zavarja a meghatározást, mivel a szennyezők rendszerint elválnak a meghatározás során a vizsgált komponenstől, és így nem befolyásolják a meghatározást. A kromatográfiás rendszer optimalizálása alapvető követelmény, és igen fontos, hogy a kalibrációhoz használt standard vegyületek szerkezete és tulajdonságai közel álljanak a vizsgált vegyületekéhez. A kísérleti körülmények pontos betartásával a vegyületek logP értéke ±0,05 pontossággal határozható meg.

Nagyhatékonyságú-folyadékkromatográfiás eljárás
A fordított fázisú, megoszláson alapuló folyadékkromatográfiás eljárás (RP-HPLC) elviekben az előzőkben bemutatott fordított fázisú VRK-módszerhez hasonlítható. A HPLC-s eljárás során a lipofilitással arányos ún. kapacitás állandót (logk') határozunk meg:

ahol logk' a HPLC-s kapacitási tényező logaritmusa, V_S az állófázis, V_M a mozgófázis térfogata (V_S/V_M = fázisarány, az adott kromatográfiás rendszerre jellemző állandó), K_HPLC a kromatográfiás megoszlási hányados.
A logk' értékek meghatározását követően, a vékonyréteg-kromatográfiához hasonlóan kalibrációs egyenes felhasználásával számoljuk ki a logP értékeket:

Ezekkel az eljárásokkal lehetőség nyílik a különböző geometriai izomerek elválasztására is, és ezáltal a lipofilitásuk szerinti megkülönböztetésre is.
A molekulák lipofilitásának meghatározásakor szilika felülethez kapcsolt alkil-láncokat tartalmazó fordított fázisú oszlopot használnak, amely a molekula és a felület között kialakuló hidrofób kölcsönhatásokat veszi figyelembe. Specifikus kolonnák alkalmazásával, mint az ún. IAM („Immobilized Artificial Membrane”) oszlop használatával a foszfolipofilitás határozható meg. Az IAM oszlop specifitását a szilika felülethez aminopropil-csoportokon keresztül kapcsolódó egyláncú foszfatidil-kolin alkotja. Az IAM oszlopnál hidrofób, hidrogénhidas és ion-pár kölcsönhatás is létrejön.

10.4.3Predikciós módszerek

A megoszlási hányados kísérletes módon történő meghatározására alkalmas eljárások mellett különböző, számítógépes becslésen alapuló predikciós módszerek is léteznek. A kapott lipofilitás érték az ún. kalkulált partíciós koefficiens.

Számítására számos eljárás létezik, a legelterjedtebb, legtöbb számítógépes program által használt módszer a fragmens alapú számítás, ahol az alapmolekula és a hozzá kapcsolódó fragmensek, szubsztituensek száma, pozíciója határozza meg a kalkulált logP értéket.

A módszerek jelentősége elsősorban a gyógyszerkutatás korai fázisában, a még nem szintetizált molekulák várható paramétereinek előrejelzésében áll. A predikciós módszerek pontossága messze elmarad a kísérletes eljárások pontosságától. A számítógépes módszerek alapvető hátránya, hogy általuk az ionos vegyületek, illetve a geometriai izomerek lipofilitása nem határozható meg, hiszen a töltésből, illetve térbeli elhelyezkedésből adódó lipofilitásbeli különbségek nem befolyásolják a számítást. A módszerek megbízhatóságát és alkalmazhatóságát is a mért értékekkel való összehasonlítás adhatja meg.