AZƏRƏbaycan miLLİ elmlər akademiyasi zoologiya institutu

2.2.Parazitin reproduktivliyinin öyrənilmə üsulları
Parazitin reproduktivliyinin öyrənilməsi aşağıdakı qaydada yerinə yetirilmişdir. İnvaziyanın 6-cı günündən başlayaraq yoluxdurulmuş və müalicə olunmuş quşların zılı hər gün ayrı-ayrılıqda yığılıb yaxşı-yaxşı qarışdırılmış və hər bir nümunədən 2q götürülərək üzərinə 10ml doymuş xörək duzu məhlulu əlavə edilib qarışdırılaraq sentrifuqa edilmişdir (3000 dövr/dəqiqə). Supernatant başqa sınaq şüşəsinə keçirilmiş, qarışdırılmış və dərəcələnmiş pipetka ilə oosistaların suspenziyasından 0,01 ml götürərək əşya şüşəsi üzərinə qoyulub mikroskop (Axio Sckope A1) altında bütün oosistalar sayılmışdır.

Statistik dürüst nəticələr almaq üçün hər supernatantdan 5 nümunə götürülüb sayılmış, riyazi hesablama yolu ilə 2q nümunədə olan oosistaların sayı müəyyənləşdirilmişdir.

2.3. Qanın morfoloji göstəricilərinin təyini metodları
Hematoloji analizlər üçün lazım olan qan nümunələri, tədqiqatın gedişindən asılı olaraq cücələrin qanadaltı venasından və dekapitasiyası zamanı götütülmüşdür. Qanın laxtalanmasının qarşısını almaq üçün antikoaqulyant kimi 1%-li heparindən istifadə edilmişdir. Bu məqsədlə 5 ml qana 1 damcı heparin əlavə olunmuşdur. Heparinli qan sınaq şüşələrində soyuducuda 4⁰C temperaturda 1 sutka saxlanılmışdır.

Qanın hematoloji göstəricilərindən eritrositlərin və leykositlərin sayı, hemoqlobinin miqdarı, leykositar formula hematologiyada qəbul edilən üsullarla təyin edilmişdir [31 s.20-32 , 72].

Qanın formalı elementlərinin boyanmasında Romanovski-Qimza, May-Qryun-

vald və Papenqaym üsullarından istifadə edilmişdir [31 s.42-45].

Qanın formalı elementlərinin Romanovski-Qimza üsulu ilə boyamaq üçün 1q azur II neytral suda həll edildikdən sonra onun üzərinə 1l-ə qədər neytral su əlavə edilmişdir. 1 q eozin də ayrılıqda 1 l distillə suyunda həll edildikdən sonra onun üzərinə hər 100 ml hesabı ilə 1-2 ml qliserin əlavə edilmişdir. Sonra suyun hər 1ml –nə 4 damcı eozin əlavə edildikdən sonra onun da üzərinə həmən miqdarda azur II əlavə edilmişdir. Rənglərin optimal nisbəti kontrol preparatın boyanması ilə müəyyən edilmişdir.

Preparatları boyamazdan əvvəl hər 1 ml suya 1-5 damcı boyaq hesabı ilə duruldulmuşdur. Yaxmanın üzərinə boyaq əlavə edildikdən 30 dəqiqə sonra, preparat axar su altında yaxşı-yaxşı yuyulub sonra qurudularaq mikroskop altında baxılmışdır.

Qanın formalı elementlərini May-Qryunvald üsulu ilə boyamaq üçün eozin-turş metilen göyünün metil spirtində 1%-li məhlulu hazırlandıqdan sonra onun üzərinə 50 ml qliserin əlavə edilmişdir. Preparatın boyanması üçün yaxmanın üzərinə 10 damcı boyaq əlavə edildikdən 5 dəqiqə sonra onun da üzərinə həmən miqdarda su əlavə edilərək qarışdırılır. 7 dəqiqədən sonra yaxma soyuq su ilə yuyularaq qurudulduqdan sonra mikroskop altında baxılmışdır.

Qanın formalı elementlərini Papenqaym üsulu ilə boyamaq üçün Romanovski-Qimza və May-Qryunvald boyalarından istifadə edilmişdir. Bu zaman yaxma May-Qryunvald boyağı ilə boyanıb üzərinə su əlavə edidikdən sonra, yaxma havada qurudulub üzərinə Romanovski-Gimza boyağı əlavə edilərək 20 dəqiqədən sonra, axar su altında yuyularaq qurudulub mikroskop (Axiosope A1) altında baxılmışd;r.

Bu boyaqlardan istifadə edərək eritrositlər və leykositlər Qoryayev kamerası vasitəsilə hesablanmışdır. Eritrositlər kameranın diaqonalı üzrə 5 böyük kvadrata, leykositlər isə 16 kiçik kvadratlara bölünən 5 üfüqi kvadrata görə sayılmışdır.

Eritrositlərin hesablanmasında aşağıdakı düsturdan istifadə edilmişdir:

(2.1)

burada: x- 1 mm³ qanda olan eritrositlərin sayı

y – 5 böyük kvadratda olan eritrositlərin sayı,

n- qanın durultma dərəcəsi (1:100)

80 – eritrositlər sayılan kiçik kvadratların sayı.

Leykositlərin sayının hesablanması zamanı isə aşağıdakı düsturdan istifadə edilmişdir.

(2.2)
burada: x- 1 mm³ qanda olan leykositlərin sayı

n- kameranın 5 zolağında sayılan leykositlərin sayı

y – qanın durultma dərəcəsi (1:100)
Leykositar formulanın hesablanmasında 8 düyməli hesablayıcıdan və mikroskopdan (Axio Scope. A1) istifadə edilmişdir. Bunun üçün mikroskopun obyektivi (x20) yaxmanın mərkəzinə gətirilmiş, sonra isə əşya şüşəsi mərkəzdən kənara doğru hərəkət etdirərək, görünüş sahəsində olan hüceyrələr sayılmışdır. Statistik dürüst məlumatlar almaq üçün yaxmanın 4 küncünün hər birindən 50, cəmi 200 hüceyrə sayılmışdır. Alınan nəticələr %-lə ifadə olunmuşdur.

Hemoqlobinin miqdarının təyin edilməsində hematologiyada qəbul edilən ümumi metodlardan istifadə edilmişdir [31, s.42-45].

2.4.Ümumi zülal və zülal fraksiyalarının təyin edilmə metodları
Ev toyuqlarının eymeriozu (E.tenella) və müalicəsi zamanı orqanizmdə baş verən biokimyəvi dəyişiklikləri öyrənmək üçün təcrübə cücələri parazitin inkişaf mərhələlərinə uyğun olaraq invaziyanın 3, 5, 7 və 10-cu günləri dekapitasiya edilmişdir.

Sınaq şüşələrinə toplanan qan 45-60⁰ bucaq altında ştativə qoyulmuşdur. Qan

laxtası əmələ gəldikdən sonra qan zərdabının tam ayrılması üçün laxta nazik metal məftil vasitəsilə sınaq şüşəsinin divarından ayrılmışdır. Sınaq şüşəsi 2 saat 37⁰S temperaturda termostatda saxlanılmışdır. Qan zərdabı tam ayrıldıqdan sonra onu pipetka vasitəsilə sınaq şüşəsindən toplayaraq digər sınaq şüşəsinə tökülmüşdür. Təcrübələrdə bu üsulla ayrılmış qan zərdabından istifadə edilmişdir.

Toxumalarda ümumi zülal və zülal fraksiyalarını təyin etmək üçün 1:6 nisbətində (kütlə/həcm) toxuma fizioloji məhlulda əzilmişdir. Toxuma homogenatı hazırlamaq üçün şüşə homogenizatordan istifadə edilmişdir. Toxumaların qızmasının qarşısını almaq üçün homogenizator buzlu suda yerləşdirilmişdir. Homogenat 1 sutka (4°S) soyuducuda saxlandıqdan sonra 30 dəqiqə (metodikalara uyğun olaraq 7000-24000 dövr/dəqiqə) müddətində sentrifuqa (K-24) edilmişdir. Alınan supernatantda suda həll olan ümumi zülalın miqdarı Louri [49] metodu, zülalların fraksiyaları isə poliakrilamidgel elektrofarez metodu [54 s.159-138, 158] ilə təyin edilmişdir. Ümumi zülalın miqdarı q%, zülal fraksiyalarının miqdarı isə ümumi fraksiyaların çəminə görə % ilə ifadə edilmişdir.

Zülalların fraksiyalara ayrılmasında “REANAL” (Macarıstan, Budapeşt) aparatından və Siqma firmasının istehsalı olan reaktivlərdən istifadə edilib. Hər bir şüşə borucuğa daxil edilən nümunələrdə ümumi zülalın miqdarı 300 mkq olmuşdur (ümumi zülalın miqdarı əvvəlcədən təyin edilmişdir).

Elektrod buferi kimi 1:10 nisbətində bidistillə su ilə durulaşdırılmış TRİS-qlisin buferindən istifadə olunmuşdur (Ph 8,3). Elektrodlar platindəndir. Elektroforetik kamera elektrod buferi ilə doldurulduqdan sonra soyuducuya yerləşdirilmiş (4°S), gözlə görünən rəngli “nişanlayıcı” xəttin (bromfenol göyün) ayrıcı gelə daxil olduğu vaxta qədər 120 volt, sonra isə 300 volt gərginlik verilmişdir.

Proses başa çatdıqdan sonra gellər şüşə borucuqdan çıxarılıb 7%-li sirkə turşusunda hazırlanmış 0,5%-li qara amidinlə (amido blac) rəngləndikdən sonra artıq qalan rəng 7%-li sirkə turşusunda yuyulmuşdur.

Tam yuyulmuş gellərdə olan zülal fraksiyalarının foto və sxematik şəkilləri çəkilmiş, brom fenol göyün gellər üzərində yerinə görə onların elektroforetik hərəkət sürətləri (EHS), (Rf) hesablanmışdır. Gellər üzərində olan hər bir fraksiyada zülalın miqdarını təyin etmək üçün UT-7608 densitometrində (Litva, Tartu) gellərin densitoqrammaları yazılmışdır. Densitoqrammalar üzərində zülalları əks etdirən “piklərin” sahəsi aşağıdakı düsturla hesablanmışdır.

(2.4)

burada:

h-densitoqrammalar üzərində əyrilərin hündürlüyünü (mm);

a- densitoqrammalar üzərində əyrilərin enini (mm) göstərir.

2.5.Amin turşuların təyin edilmə metodları
Amin turşuların öyrənilməsində AAA881 amin turşu analizatorundan istifadə edilmişdir. Cücələrin dekapitasiyasından sonra tez bir anda bud əzələləri, qaraciyər və beyin əlavə toxumalardan təmizləndikdən sonra homogenizasiya olunmuşdur.

Toxumada ümumi amin turşu tərkibini müəyyən etmək üçün 100-150 mq toxuma homogenatı sınaq şüşəsinə tökülərək üzərinə 6N HCl turşusu (1:200) əlavə edilmişdir. Sonra material 110⁰S temperaturda 70 saat müddətində hidroliz edilmişdir.

Bağlı amin turşuların toxuma homogenatında miqdarını müəyyən etmək üçün 150-200 mq toxumanın zülalları 12%-li trixlorsirkə turşusunun məhlulunda çökdürülmüşdür. Nümunə sentrifuqa olunduqdan sonra zülal çöküntüsünün üzərinə 1:99 nisbətində qarışdırılan hidrogen peroksid və qarışqa turşusu məhlulu əlavə edilərək bu vəziyyətdə 12 saat saxlanılmışdır. Sonra onun üzərinə 6N HCl turşusu əlavə edilərək ampulaların ağzı yapışdırıldıqdan sonra 110⁰S-də 18 saat müddətində hidroliz edilmişdir. Metionin və sistinin miqdarını dəqiq müəyyən etmək üçün zülallar əvvəlcədən oksidləşdirilmişdir.

Şüşələr açıldıqdan sonra ampulada olan nümunə vakuum altında rotasion buxarlandırıcıda qurudulmuşdur, quru qalıq sitrat-bufer (Ph 2,2) məhlulunda həll

edilərək analizatorda analiz edilmişdir.

Toxuma homogenatında sərbəst amin turşuları müəyyən etmək üçün beyindən 1,4-2q, qaraciyər və əzələdən isə 2-2,5q götürülərək doğrandıqdan sonra üzərinə 1:10 nisbətində 1%-li pikrin turşusu əlavə edilərək şüşə homogenazatorda homogenizasiya edilmişdir. Beyinin hogenizasiyası zamanı bu nisbət 1:15 olmuşdur. Yaranan çöküntü (10 dəqiqə müddətində 8000 dövr/dəqiqə ) sentrifuqalama (K-24) vasitəsilə kənar edilmişdir. Qalan maye xloroformun iştirakı ilə APA-2n ionitindən keçirilmişdir. Sonra kolonkanın divarları 0,02N HCl turşusu ilə yuylmuşdur. Toplanan elyuant rotasion buxarlandırıcıda vakuum altında qurudulduqdan sonra sitrat litium buferində (Ph2,2) həll edildikdən sonra analiz edilmişdir.

Zülal hidrolizatlarında amin turşuların analizi aşağıdakı qaydada aparılmışdır. Əsas komponentlərin ayrılması kiçik kalonkada sitrat-natrium buferinin iştirakı ilə (0,35N, Ph5,28) aparılmışdır. Turş və neytral amin turşuların ayrılması da sitrat-natrium buferinin (0,2N, Ph 3,25) iştirakı ilə böyük kalonkada aparılmışdır.

Təbii qarışıqda sərbəst amin turşuların analizi aşağıdakı qaydada aparılmışdır. Əsas komponentlər orta kalonkada sitrat-natrium (0,38N, Ph 4,26) buferinin iştirakı ilə 30⁰C da, histidinin qeyd edilməsinə qədər aparılmışdır. Sonra temperatur 53⁰C qaldırılmışdır. Turş və neytral komponentlərin analizi böyük kalonkada sitrat-litium buferinin (0,3N, Ph 2,8) iştirakı ilə, alanin qeyd edilənə qədər aparılmış, sonra sitrat-litium (Ph 4,15) məhlulundan istifadə olunmuşdur. Bütün analiz müddətində kolonkada temperatur 38⁰S olmuşdur.

Amin turşuların miqdarını təyin etmək üçün təcrübələrdə alınan əyrilər standart əyrilərlə müqayisə edilmişdir. Amin turşuların miqdarı mkmol ilə ifadə edilmişdir.

Əyrilərin müqayisəsi zamanı amin turşuların miqdarının hesablanmasında aşağıdakı düsturdan istifadə edilmişdir.

(2.5)

burada: H- pikin hündürlüyü, W-pikin eni, C-kalibrovka sabiti.

2.6.Fermentlərin aktivliyinin təyin edilmə metodları

Aminotrasferazaların, alaninaminotransferazanın (ALT- EC.2.6.1.2.) və aspar-tataminotransferazanın (AST - EC.2.6.1.1.) aktivliyi dinitrofenilhidrazin (Raytman və Frenkelə görə) metodu ilə təyin edilmişdir [47].

Bu metodun mahiyyəti ondan ibarətdir ki, aspartat – və alaninaminotras-ferazanın təsirindən peraminləşmə nəticəsində oksaloasetat və piroüzüm turşusu əmələ gəlir. Oksaloasetat fermentativ reaksiyalar nəticəsində piroüzüm turşusuna çevrilmək xüsusiyyətinə malikdir. 2,4 dinitrofenilhidrozin əlavə edildikdən sonra piroüzüm turşusunun hidrozonu yaranır ki, o da qələvi mühitdə qırmızı qəhvəyi boyanır. Rəngin intensivliyi əmələ gələn piroüzüm turşusunun miqdarı ilə düz mütənasibdir.

Quşlar dekapitasiya olunduqdan sonra tez bir anda çıxarılan toxumadan 1 q toxuma götürülərək üzərinə 1:9 nisbətində 0,25M saxaroza məhlulunda hazırlanan 0,1 mM ETDA əlavə edilərək şüşə homogenizatorda əzilmişdir. Toxumanın qızmasının qarşısını almaq üçün şüşə homogenizator buzlu suyu olan stəkana yerləşdirilmişdir. Alınan homogenat 10 dəqiqə 5000 dövr/dəqiqə sentrifuqa (K24 sentrifuqasında) edilmişdir. Supernatant saxaroza məhlulunda 1:50 nisbətində duruldulmuşdur. Aspartataminotrasferazanın aktivliyini təyin etmək üçün sınaq şüşəsinə 0,5 ml substrat məhlulu əlavə edilmişdir. Sonra onun üzərinə 0,1 ml homogenat əlavə edildikdən sonra sınaq şüşəsi 1 saat müddətində 37⁰C-də termostatda saxlanılmışdır. Sonra üzərinə 0,5 ml dinitrofenilhidrazin əlavə edildikdən sonra nümunə 20 dəqiqə müddətində otaq temperaturunda saxlanılmışdır. Vaxt tamam olandan sonra üzərinə 5 ml 0,4 N natrium hidrooksid (NaOH) məhlulu əlavə edilərək otaq temperaturunda 10 dəqiqə rəngin intensivləşməsi üçün saxlanılmışdır. Nümunənin optiki sıxlığı СФ-26 spektrofotometrində 530 nm dalğa uzunluğunda ölçülmüşdür. Kontrol nümunədə homogenatdan başqa bütün inqridentlər olmuşdur. Homogenatın əvəzinə nümunəyə 0,1 ml bidistilyat əlavə edilmişdir. Kontrol nümunə də, təcrübə nümunəsi kimi eyni şəraitdə inkubasiya edilmişdir.

Aspartataminotransferazanın aktivliyini təyin etmək üçün sınaq şüşəsinə əlavə edilən 0,5 ml substratın üzərinə 0,1 ml homogenat əlavə edilərək termostatda 30 dəqiqə müddətində 37⁰S temperaturda inkubasiya edilmişdir. Analizin sonrakı mərhələsi alaninaminotransferazanın aktivliyinin müəyyən edilməsi zamanı istifadə olunan üsulda olduğu kimi olmuşdur. Aminotrasferazanın aktivliyinin hesablanması piroüzüm turşusuna görə qurulan kalibrovka əyrisinə görə hesablanmışdır.

Aminotransferazaların aktivliyinin təyin edilməsi üçün kalibrovka əyrisini qurmaq məqsədilə 0,05 ml dən 0,25 ml-ə qədər (0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 025; 0,30 ml pruvat) olan substratın üzərinə 0,5 ml 2,4-dinitrofenilhidrazin əlavə edilərək otaq temperaturunda 20 dəqiqə inkubasiya edilmişdir. Sona hər bir sınaq şüşəsinə 5 ml 0,4N NaOH əlavə edilərək qarışdırılmış və 30 dəqiqədən sona sınaq şüşələrində olan məhlulların 537 nm dalğa uzunluğunda optiki sıxlığı ölçülmüşdür. Qrafikin ordinant oxunda göstərilən hər bir nümunənin optiki sıxlığı və absis oxunda isə ALT və AST-nın müvafiq aktivliyinə görə kalibrovka əyrisi qurulmuşdur.

ALT (AST) –nin aktivliyinin hesablanmasında
(2.7)
düsturundan istifadə edilmişdir.

Burada: E_n- təcrübə nümunəsinin optiki sıxlığını, E_k-kontrol nümunənin optiki sıxlığıdır.

K sabiti kalibrovka əyrisinə görə 2.8 düsturundan istifadə etməklə hesablanmışdır.

K=C/E (2.8)
ALT və AST-nin aktivliyi mkmol/q(ml)·saat ilə ifadə edilmişdir. Fermentlərin aktivliyinin hesablanmasında homogenatın duruldulması nəzərə alınmış, hesablamalarda 1 q toxumaya (mq zülal) görə ifadə edilmişdir.

Qan zərdabında laktatdehidrogenazanın (EC 1.1.1.27) (LDH) aktivliyi 2,4-dinitrofenilhidrazin reaksiyasına (Sevel-Tovareka metodu) görə təyin edilmışdir [56 s.223-226]. Bu metodun əsasında qan zərdabında L-laktatın nikotinamid-adenin-dinukleotidin təsirindən piruvata oksidləşməsi durur. 2,4-dinitrofenilhidrazinin rəngli reaksiyasına əsasən isə fermentin (LDH) aktivliyi təyin edilir.

LDH-nın aktivliyini təyin etmək üçün 1:2 nisbətində duruldulan 0,1 ml qan zərdabı 0,3 ml NAD məhlulu ilə qarışdırılıb, 5 dəqiqə 37⁰S temperaturda saxlandıqdan sonra üzərinə 0,8 ml 0,03 mol/l natrium pirofosfat və əvvəlcədən 37⁰S-yə qədər qızdırılmış 0,02 ml 0,45mol/l natrium laktat əlavə edilib 37⁰S-də 15 dəqiqə müddətində inkubasiya olunmuşdur. İnkubasiyadan həmən an sonra onun üzərinə 0,5ml 2,4-dinitrofenilhidrazin əlavə edilərək otaq temperaturunda 20 dəqiqə saxlanılmış, sonra onun üzərinə 5 ml 0,4mol/l natrium hidrooksid məhlulu əlavə edilərək 10 dəqiqə gözlədikdən sonra spektrofotometrdə optiki yolu 1 sm olan küvetdə, 500nm dalğa uzunluğunda optiki sıxlığı ölçülmüşdür. Kontrol nümunənın tərkibi təcrübə nümunəsində olduğu kimi olmuş, lakin qan zərdabı inkubasiyadan sonra əlavə edilmişdir.

Fermentin aktivliyinin hesablanması kalibrovka qrafikinə görə hesablanmışdır. Kalibrovka qrafiki qurmaq üçün işçi məhlul hazırlamaq məqsədilə kristal natrium piruvatın 11mq-nı az miqdarda distillə suyunda həll etdikdən sonra 100 ml-lik kolbaya tökülərək onunda üzərinə nişana qədər distillə suyu əlavə edilmişdir. 1,0 ml məhlulda 88mkq piroüzüm turşusu olmuşdur. İşçi kalibrovka məhlulu əsas məhlulun 10 dəfə duruldulması nəticəsində hazırlanmışdır (1ml məhlulda 8,8 mkq piroüzüm turşusu olmuşdur).

Kalibrovka qrafikini qurmaq üçün 5 ədəd sınaq şüşəsi götürülüb onların hər birinə müvafiq olaraq 0,1; 0,2; 0,4; 0,6 və 0,8 ml natrium piruvatın kalibrovka üçün duruldulan məhlulların əlavə edildikdən sonra onun da üzərinə 0,8 ml 0,03mol/l pirofosfat məhlulu əlavə edilmişdir. 1-ci, 2-ci və 3-cü sınaq şüşələrinə müvafiq olaraq 0,5, 0,4 və 0,2 ml bidistillə su əlavə edilmiş, 4-cü və 5-ci sınaq şüşələrinə isə su əlavə edilməmişdir. Sınaq şüşələrində onların sıra nömrələrinə uyğun olaraq piroüzüm turşusunun mıqdarı 0,88 mkq (0,01mkmol), 1,76 (0,02 mkmol), 3,52 mkq (0,04 mkmol), 5,28 (0,06 mkmol), 7,04 (0,08mkmol) olmuşdur. Qeyd edilən ardıcıl-lığa uyğun olaraq LDH aktivliyi 334, 668, 1336, 2004 və 2672 nmol/saat l olub.

Sonra sınaq şüşələrinin hər birinə 0,5 ml 2,4-dinitrofenilhidrazin məhlulu əlavə edilmişdir. Sonra kalibrovka nümunələrinin optiki sıxlığı təcrübədə olduğu kimi ölçülmüşdür. Xolostoy nümunələrin optiki sıxlığı da eyni qayda ilə ölçülmüşdür. Lakin kalibrovka məhlulu əvəzinə distillə suyu əlavə edilmişdir. LDH aktivliyi nmolNAD/saat l ilə göstərilmişdir.

X=C·30·4/88 (2.9)
burada:

X – LDH aktivliyi, nmol/saat·l;

C – kalibrovka nümunəsində piroüzüm turşusunun miqdarı, mkq;

30 – 1 ml qan zərdabı üçün hesablama sabiti;

4 – 1 saat inkubasiya üçün hesablama sabiti;

88 – 1 mkmol piroüzüm turşusunun çəkisi, mkq.

Eritrositlərdə qlükoza-6-fosfatdehidrogenazanın (Q-6FDH) (EC1.1.1.49) aktivliyi spektrofotometrik metodla öyrənilmışdir. Bu metod qlükoza 6-fosfatın fosfoqlükolaktona oksidləşməsi zamanı NADF·H-ın miqdarının spektrofotometrik üsulla təyininə əsaslanır [55 s.31-32]. Bu metoda görə qan 10 dəqiqə 3000 dövr dəqiqə (BioSan LM-3000) sentrifuqa edildikdən sonra plazma atılıb, çöküntü soyuq fizioloji duz məhlulunda yuyulmuşdur (antikoaqulyant kimi natrium sitratdan istifadə edilmişdir). Sınaq şüşələrindən birinə 4,7 ml fizioloji duz məhlulu, digərinə isə 4,7 ml inisiastor mühiti (4,1 ml buferləşdirilmış fizoloji duz məhlulu (136 q KH₂PO₄·2H₂O + 70 q NaON+ 1L -ə qədər distillə suyu) + 0.5 ml askorbin turşusu məhlulu + 0,05 ml dəmir sulfat məhlulu + 0,05 ml D₃ vitaminin spirtdə məhlulu) əlavə edilmişdir. Sonra sınaq şüşələrinin hər birinə 0,3 ml yuyulmuş eritrosit əlavə edilərək 30 dəqiqə 37⁰S-də inkubasiya olunmuşdur. Eritrositlərin hemolizatı isə aşağıdakı qaydada hazırlanmışdır. 0,3 ml eritrosit çöküntülərinin hər birinin üzərinə 1,2 ml soyuq distillə suyu əlavə edilərək (0,02% diqitonin məhlulunun iştirakı ilə) 4⁰S-də 30 dəqiqə saxlanıldıqdan sonra 3000 dövr/dəqiqə sürətlə 10 dəqiqə sentrifuqa

olunub. Sentrifuqatdan tədqiqatlarda istifadə olunmuşdur.

Fermentin aktivliyini təyin etmək üçün spektrofotometrin küvetinə 2,9 ml trietanol buferi, 0,02 NAD və 0,02 ml hemolizat əlavə edilib qarışdırılmışdır, otaq temperaturunda (25⁰S) 5 dəqiqə saxlanıldıqdan sonra onun üzərinə qlükoza 6-fosfat əlavə edilmişdir. Substrat məhlulu əlavə edilən kimi nümunənin 340 nm dalğa uzunluğunda 5 dəqiqə müddətində, hər dəqiqədə bir optiki sıxlığı ölçülmüşdür.

Hesablama aşağıdakı düsturla aparılmışdır:

A=	16,45·ΔE/dəqiqə	( 2.10)
	a

Burada:

A – fermentin aktivliyi, mkmol/saat·qHb

a – nümunədə hemoqlobinin miqdarı

ΔE – bir dəqiqə üçün nümunənin optiki sıxlığının orta qiyməti

Eritrositlərdə qlutationreduktazanın (QR) (EC.1.6.4.2) aktivliyini təyin etmək üçün 1:10 nisbətində distillə suyu ilə yuyulmuş eritrositlərdən 0,05 ml götürərək, içərisində 1,8 ml 0,1M kalium fosfat buferi (pH 7,0) 1mM EDTA və 0,1 ml oksidləşmiş qlutation olan (optiki yolu 10 mm) küvetə əlavə edilmişdir. Sonra məhlulun üzərinə 0,1 ml NADF·H əlavə edilərək 3 dəqiqə müddətində 340 nm dalğa uzunluğunda optiki sıxlığı ölçülmüşdür [55 s.223-225].

Fermentin aktivliyi mkmol/dəqiqə·l ifadə edilərək aşağıdakı düsturla hesablanmışdır:

(2.11)

Burada:

A – fermentin aktivliyi, mkmol/dəqiqə·l;

ΔE- inkubasiyadan əvvəl və sonra ölçülən optiki sıxlıq arasında olan fərq;

V_p.c- məhlulun həcmi – 2,05 ml;

V_m.p.- hemolizatın həcmi – 0,05 ml;

l – optiki yolun uzunluğu – 1 sm;

ε - NADF·H-ın 340 nm dalğa uzunluğunda işıq udma sabiti – 6,22x10³ M^-1·sm^-1;

t – inkubasiya müddəti – 3 dəqiqə;

10⁶ – mol-u mkmol-a çevirmək üçün sabit;

11 – hemolizatın durultma dərəcəsi.
Cücələrin nazik bağırsağında qələvi fosfatazanın (EC 3.1.3.1) aktivliyini müəyyən etmək məqsədilə dekapitasiya invaziyanın gedişinə uyğun olaraq yoluxdurmadan 3, 5, 7 və 10 gün sonra aparılmışdır. Kontrol cücələr də bu günlərə uyğun olaraq dekapitasiya edilmişdir. Təcrübə materialı dekapitasiyadan həmən an sonra nazik bağırsaqdan götürülən qaşıntı olmuşdur. Aktivliyin təyin edilməsi qələvi fosfatazalar üçün optimal pH-da (pH 9.0-9.2) aparılmışdır. Qələvi fosfatazanın aktivliyi Alkaline Phosphatase Colorimetric Assay Kit vasitəsilə təyin edilmişdir. Alınan göstəricilər mmol/l ilə ifadə edilmişdir.

Nəticələrin statistik işlənilməsi IBM SPSS Statistics 20 proqramı vasitəsilə həyata keçirilmiş, alınan rəqəm göstəricilərinin müqayisəsi zamanı M±Sd şəklində ifadə edilmişdir.

Qruplar arasında fərqin statistik dürüstlüyü Styudentin t-kriteriyası və Van-der Vardenin X kriteriyası vasitəsilə yoxlanılmışdır. P≤0.05 olduqda baş verən dəyişikliklərin statistik dürüst olduğu qəbul edilmişdir. Cədvəllərdə “P” göstəriciləri kontrol qrupun göstəriciləri ilə müqayisə edildikdə P, yoluxdurulmuş qrupun göstəriciləri ilə müqayisəsi zamanı isə P₁ kimi göstərilmişdir.
III FƏSİL

EKSPERİMENTAL EYMERİOZ ZAMANI (EIMERIA TENELLA) CÜCƏLƏRİN ORQANİZMİNDƏ BAŞ VERƏN PATOLOJİ

ANATOMİK DƏYİŞKƏNLİKLƏR VƏ ONLARIN EYMERİOZA QARŞI DÖZÜMLÜYÜNÜN MÜƏYYƏNLƏŞDİRİLMƏSİ
Parazit-sahib sistemində ortaqların təsiri qarşılıqlı xarakter daşıyır, hər biri digəri tərəfindən çoxsaylı qarşılıqlı təsirə məruz qalır. Qapalı dövriyyədə əsas faktor hər bir ortağın bioloji xüsusiyyətləridir. Bu halda parazitdə virulentlik, reproduktivlik xüsusiyyəti, immunokomponentliyi və digər xüsusiyyətləri, sahibin isə yaşı, cinsiyyəti, immunoloji vəziyyəti və xüsusiyyətləri böyük əhəmiyyət kəsb edir. Ortaqların qarşılıqlı təsiri qeyd edilən ümumi fizioloji faktorlarla kifayətlənmir. Bu mürəkkəb prosesə ekoloji xarakterli faktorlar və metabolizm prosesləri də qoşulur. Buna görə də eymeriozun patogenezinin hərtərəfli xarakterizə etmək üçün kompleks parazitoloji, biokimyəvi, morfoloji, klinik və digər müşahidələr nəzərə alınmalıdır.

Eymeriyalar unikal çoxalma qabiliyyətinə malik olduqlarından sahibin orqanizminə düşdükdən 3-5-gün sonra öz təsirini göstərir. Yoluxdurulmuş cücələrdə eymeriozun klinik əlamətləri parazitin sahibin bağırsağında inkişaf mərhələlərinə (generasiyasına) uyğun olaraq dərinləşir. İnvazıyanın 3-cü günü cücələrin sağlam görünmələrinə baxmayaraq, kəsilmış quşların kor bağırsaq çıxıntısının şişdiyi və zədələndiyi müşahidə olunur. Parazitin bağırsaqda inkişafı nəticəsində onun tamlığı pozulur, qan damarları və sinirlər zədələnir. Bağırsağın tamlığının pozulduğu yara yerlərində patogen mikroorqanizmlər fəallaşır. Quşlar yaxşı qidalanmadıqlarından və həzm sisteminin fəaliyyəti pozulduğundan onlar arıqlayır, çəki artımı azalır, immun sistemi zəifləyir [274, 13 s.41-50].

Eimeria tenella tərəfindən törədilən xəstəliyin klinik əlamətləri adətən cücələrin bağırsağında merontların ikinci generasiyasından sonra müşahidə olunur.

Patogen növlə yüksək yoluxmalar zamanı eymeriozun kəskin klinik əlamətləri yoluxdurmanın 5-ci günü özünü göstərir. Bu dövrdə cücələr bir yerə toplaşırlar, qanadları sallanır, lələkləri pırpızlaşır, az yem yeyirlər, qanlı ishal başlayır. Bu vəziyyət patent dövrünün sonuna qədər davam edir. İnvaziyanın 5-6-cı günlərindən başlayaraq cücələrin zıllarında qan izləri müşahidə olunur və cücələr arasında ölüm halları başlayır. 7-ci gündən sonra sağ qalan cücələr tədricən öz aktivliyini və yem qəbulunu bərpa etməyə başlayırlar. Postpatent dövrünün sonlarına yaxın eymeriozun klinik əlamətləri itsə də xəstə cücələr zəif görünür və çəki artımları da sağlamlara nisbətən az olur.

Yerli cinsdən olan xəstə quşlarda xəstəliyin klinik əlamətlərinin plimutrok cinsinin göstəricisi ilə müqayisəsi göstərir ki, sonuncularda bu əlamətlər eyni doza ilə yoluxdurmaya baxmayaraq daha kəskin forma alır. Yerli cinsdən olan toyuq cücələrinin kor bağırsaqlarının divarında yara yerlərinə təsadüf edilməsinə baxmayaraq onların ölçüləri broyler cücələrinin bağırsaqlarının divarlarında müşahidə edilən yara yerlərinə nisbətən kiçikdir və bağırsaq mexaniki zədələnməyə nisbətən az məruz qalır.

Kulturanın virulentliyindən və yoluxdurma dozasından asılı olaraq xəstəliyin klinik əlamətləri tez özünü büruzə verə bilir. 3-cü gün yüksək dozada yoluxdurma zamanı (hər bir cücəyə 20000 və yuxarı doza) cücələr arasında ölüm hallarına səbəb olmaqla, quşlar arasında depressiyaya, xəstəliyin zəif simptomlarının meydana çıxmasına səbəb olur. Cücələr az hərəkətli olur, yemdən az istifadə edir, suya tələbat artır. Onların yarılması zamanı kor bağırsağın zəif şişməsi müşahidə olunur.

İnvaziyanın 4-cü günü iştahanın itməsi və suya kəskin tələbatın artdığı müşahidə olunur. Eymerioz üçün xarakterik əlamət invaziyanın 5-ci günü müşahidə olunmağa başlayır. Bu zaman cücələr ancaq yemdən deyil, sudan da imtina edir, qanadları sallanır, lələkləri pırpızlaşır, pipikləri və ayaqlarının dərisinin rəngi ağarır. Qıc olma halları başlayır, cücələr hərəkət edə bilmir. Cücələrin ifrazatlarının rənginin dəyişməsinə baxmayaraq qan müşahidə edilməmişdir. Aşağı doza ilə yoluxdurmadan fərqli olaraq parazitin yüksək – 100000 sporlaşmış oosistası ilə yoluxdurulması zamanı isə cücələrin zıllarında qan izləri müşahidə edilmişdir. 20000 sporlaşmış oosista ilə yoluxdurma zamanı cücələr arasında kütləvi ölüm halları müşahidə edil-məsə də 100000 oosista ilə yoluxdurma zamanı kor bağırsaq çıxıntısının divarların-dan qan axmağa başlayır, kor bağırsağın qan ilə dolduğu müşahidə olunmuşdur. E.tenella-nın virulent 100000 oosistası ilə yoluxdurma cücələrin cinsindən asılı olmayaraq onların əksəriyyətinin ölümünə səbəb olur.

100000 oosista ilə yoluxdurulan xəstə və ölən quşların yarılması zamanı kor bağırsağın divarlarında yara izləri müşahidə olunmuşdur. Bağırsaq həcmcə böyümüş və daxili tünd rəngli möhtəviyyatla dolmuşdur. Bağırsağın selikli qışasında aşağı dozada yoluxdurma zamanı müşahidə edilməyən, çox sayda yara yerlərinə təsadüf edilmişdir. Hətta bu yara yerləri bağırsağı yarmadan da müşahidə edilir. Tamlığı pozulan epiteli hüceyrələri bağırsağın daxilində toplanır. Qeyd edilın əlamətlər yüksək doza ilə yoluxdurma zamanı kor bağırsaq ilə kifayətlənməyib, nazik bağırsağı hətta kloakanı də əhatə edir.

Bağırsaq traktının kəskin zədələnməsinə eymeriyaların merontların ikinci və üçüncü generasiyasına və qametoqoniya dövrünə təsadüf edir ki, bu dövr E.tenella üçün invaziyanın 5-7-ci günləridir. Yaxmaların mikroskopik müayinəsi zamanı çox sayda qamontlara və formalaşmış oosistalara təsadüf edilmişdir.

E.tenella-nın yüksək dozası ilə yoluxdurma zamanı aşağı doza ilə yoluxdurmaya nisbətən digər daxili orqanlarda da dəyişiklikilər müşahidə olunmuşdur. Skelet əzələlərinə, beyin və böyrəklərdə qan sızma hallarına təsadüf edilməmişdir.

İnvaziyanın 7-ci günündən sonra sağ qalan cücələrin bağırsağında möhtə-viyyatın tədricən bərkiməsi müşahidə olunur. İnvaziyanın 10-cu günündən sonra cücələr əvvəlki günlərə nisbətən hərəkətli olur. Tədricən onların yeməyə tələbatı artır. Kor bağırsaqda yara yerlərinin izləri hələ müşahidə olunur. İnvaziyanın 5-7-ci günləri daxili orqanlara qan sızma halları artıq müşahidə olunmur. İnvaziyanın 20-ci günü cücələrin zıllarında tək-tək oosistalara təsadüf olunmasına baxmayaraq xəstəliyin klinik əlamətləri artıq hiss olunmur.

Cücələrin nisbətən zəif doza ilə və ya yüksək dozada az virulet ştamla yoluxdurulması zamanı kor bağırsağın divarında yüksək dozada virulent ştamla yoluxdurma zamanı aydın müşahidə edilən yara yerlərinə təsadüf edilməmişdir.

20000 oosista ilə yoluxdurma zamanı quşların eymeriozu üçün xarakterik olan

klinik əlamətlər xəstəliyin baykoks və baykoks ilə acı yovşanın (Artemisia absinthium) birlikdə kombinasiyası ilə müalicəsi zamanı müşahidə edilməmişdir. E.tenella-nın yuxarıda qeyd edilən dozası ilə yoluxdurulan yerli cinsdən olan qara və çil-çil cücələrin yeminə acı yovşan (1500 mq/kq yem) əlavə edilməsi cücələrin sağ qalmasına səbəb olur.

Qara və çil-çil cücələrin 100000 oosista ilə yoluxdurulması və A.absinthium ilə müalicəsi zamanı təcrübə cücələrin hamısı ölmüşdür.

100000 oosista ilə yoluxdurmadan fərqli olaraq 20000 oosista ilə yoluxdurma və ya az virulent ştamlarla yoluxdurma zamanı və həmçinin yoluxdurmanın baykoks ilə A.absinthium-un kombinasiyası ilə müalicəsində xəstəliyin klinik əlamətləri çox zəif müşahidə edilmişdir. Belə cücələrin yarılması zamanı kor bağırsağın şişməsinə baxmayaraq onun daxili divarında zəif qızartılara təsadüf edilsə də, kəskin hiss edilən yara yerləri müşahidə edilməmişdir.

Yerli cinsdən olan çil-çil və qara toyuq cücələrinin koksidioza qarşı dözümlülüyünü müəyyənləşdirmək üçün cücələr 20 günlük yaşa çatana qədər institutun vivariumunda xüsusi otaqda tordan hazırlanmış dəmir qəfəslərdə saxlanılmışdır. Cücələrin təcrübə dövründə eymeriyalarla spontan yoluxmasının qarşısını almaq uçun qəfəslər, yem və su qabları, döşəmə hər gün təmizlənib qaynaq lampası alovu vasitəsi ilə dezinvaziya edilmişdir. Bütün quşlar eyni tərkibli, tərkibində antibiotik və koksidiostatik olmayan yemlə yemləndirilmişdir.

Yerli cinsdən olan toyuq cücələrinin eymeriyalara dözümlüyünü ölüm faizi və çəki artımına görə qiymətləndirmək üçün alınan məlumatlar bu istiqamətdə plimutrok cinsindən olan cücələr üzərində aparılmış tədqiqatlarda aldığımız nəticələrlə müqayisə edilmişdir [3].

Eymeriozun yaşla əlaqədar dinamikasını öyrənən tədqiqatçılar göstərirlər ki, yaşlı quşlarda eymeriyalara qarşı qazanılmış immunitet təkrar yoluxmalar nəticəsində yaranır. Buna görə də maraqlıdır ki, eymeriyaların müxtəlif dozaları və eymeriya ştamlarının virulentliyi cücələrin cinsindən asılı olaraq onlara necə təsir göstərir.

Hər iki cinsdən olan cücələrin eymerioza qarşı dözümlülüyünü müəyyənləşdir-

mək üçün yoluxdurmada E.tenella-nın virulent və müxtəlif müddət 2,5%-li kalium bixromat (K₂Cr₂O₇) məhlulunda saxlanılan oosistalarından istifadə edilmişdir.

Eyni yaşdan olan cücələrin E.tenella-nın müxtəlif dozaları ilə yoluxdurulan cücələr arasında baş verən ölüm halları cədvəl 3.1-də verilir.

Qara və çil-çil cücələrin E.tenella-nın eyni virulentli ştamları ilə yoluxdurulması zamanı müəyyən edilmişdir ki, yerli cinsdən olan cücələr eymerioza qarşı broyler cücələrinə nisbətən dözümlü olmasına baxmayaraq yoluxdurma dozasının artırılması ilə paralel olaraq xəstəliyin klinik əlamətləri kəskinləşir və cücələr arasında baş verən ölüm halları çoxalır. Bu zaman əsas ölüm halları invaziyanın 5 və 6-cı günləri, yəni patoloji proseslərin ən kəskin dövrünə düşür.

Cədvəl 3.1

Eyni virulentli Eimeria tenella-ın müxtəlif dozaları ilə yoluxdurulmuş cücələr arasında baş verən ölüm halları

Yoluxdurma dozası	Yoluxdurulan cücələrin sayı	Ölən cücələrin ümumi sayı	İnvaziyanın günlərinə uyğun olaraq ölən cücələrin sayı
			4	5	6	7	8	9	10
çil-çil cücələr
20000	30	5	0	4	1	0	0	0	0
30000	30	9	0	3	4	0	0	0	0
50000	30	10	3	3	2	0	0	0	0
80000	30	10	1	5	3	1	0	0	0
100000	30	28	5	9	9	5	0	0	0
qara cücələr
20000	30	4	0	3	1	0	0	0	0
30000	30	6	0	4	2	0	0	0	0
50000	30	7	1	3	2	1	0	0	0
80000	30	11	2	6	3	0	0	0	0
100000	30	29	6	10	9	4	0	0	0

Cədvəl 3.1-də verilən məlumatlardan aydın olur ki, virulent ştamın yoluxdurma dozasının artırılması cücələrin cinsindən asılı olmayaraq xəstəliyin klinik əlamətləri də fərqlənmir. Yoluxdurma dozasının artırılması zamanı çil-çil cücələr arasında da qara cücələr arasında olduğu kimi ölüm halları çoxalır. Parazitin 20000 oosistası ilə yoluxdurulması zamanı 30 cücədən beşi, 30000 oosista ilə yoluxdurma 9-u ölürsə, 50 və 80 min oosista ilə yoluxdurma 10, 100 min oosista ilə yoluxdurma isə 28 cücələnin ölümünə səbəb olur.

Qara cücələr arasında isə yoluxdurma dozasına müvafiq olaraq ölüm belə olmuşdur: 4, 6, 7, 11 və 29 cücə (cədvəl 3.1).

Cədvəl 3.1-də verilən məlumatları bir-biri ilə müqayisə etdikdə əsaslı bir fərq müşahidə olunmur. Hər iki cinsdən olan cücələrin 20-80 min oosista ilə yoluxdurulması zamanı cücələrin 13,3-16,7%-i ölür. 100 min oosista ilə yoluxdurma zamanı ölüm invaziyanın 4-cü günündən başlayır, 7-ci gününə kimi cücələrin 100%-i ölür.

Beləliklə, əldə edilən məlumatların müqayisəli analizindən aydın olur ki, eymeriozun xarakteri orqanizmə daxil olan parazitlərin sayından asılıdır. Eyni yaşdan olan cücələrin eksperimental koksidiozu zamanı invaziya prosesləri kəskin keçir və cücələr arasında ölüm halları ilə müşahidə olunur. Aşağı dozalarda yoluxdurma zamanı xəstəlik zəif keçir, ölüm halları az olur, təcrübə quşları invaziyanın sonunda sağalır (cədvəl 3.1). Belə ki, eyni virulentli parazitin bu və ya digər dozası ilə yoluxdurma həmişə eyni patoloji mənzərə və letallıqla müşaət olunur.

Eimeria tenella-nın müxtəlif virulentli ştamlarının yerli cinsdən olan cücələrə təsirini öyrənmək məqsədilə qara və çil-çil toyuq cücələri eyni steril şəraitdə saxlanılmış və eyni tərkibli yemlə yemləndirilmişdir. Sonra isə E.tenella-nın müxtəlif müddətdə soyuducuda (4⁰S) saxlanılmış 100 min sporlaşmış oosistası ilə yoluxdurulmuş, cücələr arasında baş verən ölüm halları və xəstə quşların orqanizmində baş verən patoloji-anatomik dəyişkənliklər izlənilmişdir.

Soyuducuda uzun müddət 2,5%-li kalium bixromat məhlulunda saxlanılan kultura ilə yoluxdurulan cücələr arasında baş verən ölüm halları cədvəl 3.2 -də verilir.

Cədvəldə verilən məlumatlara görə eyni dozada müxtəlif virulent ştamlarla

yoluxdurma cücələr arasında həmişə ölüm halları baş vermir. Yəni saxlama müddətindən asılı olaraq parazitin virulentliyinin azalması da baş verir. Cücələrin eyni sayda bir halda 20 min, digər halda isə 100 min sporlaşmış oosista ilə yolux-

durulması zamanı gözlənildiyi nəticə alınmır.

Hər iki cinsdən olan cücələri E.tenella parazitinin müxtəlif müddət saxlanılmış 20 min sporlaşmış oosistası ilə yoluxdurduqda xəstəliyin aşağıda şərh edilən mənzərəsi müşahidə olunur. Soyuducuda, 30 gün 2,5%-li K₂Cr₂O₇ məhlulunda saxlanılan oosista ilə çil-çil və qara cücələrin yoluxdurulması hər iki halda 6,67% ölümə səbəb olur (30 cücədən 2-si). 100 min oosista ilə yoluxdurma isə çil-çil və qara cücələr arasında müvafiq olaraq 80-83,8% ölümlə nəticələnir. Klinik və patoloji-anatomik dəyişkənliklər hər iki cinsdən olan cücələr arasında baş verən ölüm səviyyəsinə uyğundur.

Cədvəl 3.2

Eimeria tenella-nın müxtəlif virulentli ştamları ilə yoluxdurulan 20 günlük cücələr

arasında baş verən ölüm halları

Oosistaların saxlanılma müddəti (sutka ilə)	Yoluxdurulan cücələrin sayı	Ölən cücələrin ümumi sayı	İnvaziyanın günlərinə uyğun olaraq ölən cücələrin sayı
			4		5		6		7		8	9	10
Yoluxdurma dozası 20000 sporlaşmış oosista
çil-çil cücələr
30	30	2 (6,67,0%)	0		1		1		0		0	0	0
120	30	1 (0,33%)	0		1		0		0		0	0	0
180	30	0	0		0		0		0		0	0	0
360	30	0	0		0		0		0		0	0	0
qara cücələr
30	30	2 (6,67,0%)	0		0		2		0		0	0	0
120	30	1 (0,33%)	0		1		0		0		0	0	0
180	30	0	0		0		0		0		0	0	0
360	30	0	0		0		0		0		0	0	0
Yoluxdurma dozası 100000 sporlaşmış oosista
çil-çil cücələr
30	30	24 (80,0%)		2		5		12		8	0	0	0
120	30	20 (66,7%)		1		5		13		1	0	0	0
180	30	5 (16,7%)		0		2		2		1	0	0	0
360	30	0		0		0		0		0	0	0	0
qara cücələr
30	30	25 (83,8%)		0		7		12		6	0	0	0
120	30	20 (66,7%)		1		6		12		1	0	0	0
180	30	4 (13,3%)		1		1		2		0	0	0	0
360	30	0		0		0		0		0	0	0	0

Oosistaların saxlama müddətindən asılı olaraq yoluxdurulan cücələr arasında baş verən ölüm halları saxlama müddətinə paralel olaraq azalır. Belə ki, 120 gün saxlanılan 20 min oosista ilə yoluxdurma hər iki cinsdən olan cücələr arasında 30 cücədən birinin ölümünə səbəb olur (3,3%). Qeyd edilən müddətdə saxlanılan oosistanın 100 min dozası ilə yoluxdurma zamanı cücələrin 66.7%-i ölür (30 cücədən 20-i). 180 və 360 gün saxlanılan oosistanın 20 min dozası ilə yoluxdurma cücələr arasında ölümə səbəb olmur. Bu müddətdə saxlanılan parazitin 100 min oosistası ilə yoluxdurma birinci halda cücələrin 13.3-16.7%-nin ölümünə səbəb olursa, 360 gün saxlanılan oosista cücələr arasında ölümə səbəb olmur (cədvəl 3.2).

Beləliklə, alınan nəticələrin müqayisəli analizi göstərir ki, E.tenella-nın saxlama müddəti onun virulentliyinə təsir göstərir. Yaxşı parazitoloji effekt almaq üçün oosistaların saxlama müddəti ilə yanaşı orqanizmə daxil edilən oosistaların sayı da mühüm əhəmiyyət kəsb edir, yəni saxlama müddətindən asılı olaraq parazitin virulentliyi azalsa da, yoluxdurma dozasını artırmaqla xəstəliyin effektini yüksəltmək olar ki, bu da özünü alınan nəticələrlə sübut edir.