FəSİl IV. Fermentativ fəallığın təyini üsulları. Fermentlərin vahidləri

+ NAD⁺ → CH₃ – COH + NADH + H⁺

NAD⁺ zülal molekulunun səthin ilə piridin kofermentin tsiklinin müsbət yüklənmiş azot atomu və apofermentin mənfi yüklənmiş kükürd (HS-qrupunun tərkibinə dazil olan), eləcə də kofermentin purin tsiklinin azot atomu və apofermentin kükürd atomu arasında Zn²⁺ vasitəsilə yaranan rabitələr hesabına birləşmiş olur (şək. 5.7). Spirt molekulu fermentin fəal mərkəzi ilə O və Zn²⁺ arasında yaranan koordinasion rabitə hesabına birləşir.

Etil spirti molekulu fəal mərkəzin və etil spirtinin metil qrupu arasında hidrofob əlaqəni təmin edən mərkəzə malikdir. Müsbət yüklənmiş sink atomu etanolun spirt qrupundan protonun ayrılmasını təmin edir və nəticədə mənfi yüklənmiş oksigen atomu əmələ gəlir. Mənfi yük oksigen atomu və qonşuluqda yerləşən hidrogen atomu arasında yenidən paylaşmış olur ki, sonuncu hidrid ionu şəklində NAD” kofermentin nikotinamidinin dördüncü karbon atomuna daşınır. Nəticədə reduksiya olunmuş NADH və sirkə aldehidi əmələ gəlir (şək. 5.8).

Kovalent kataliz zamanı fermentin fəal mərkəzinin nukleofil (mənfi yüklənmiş) və ya elektrofil (müsbət yüklənmiş) qrupların substrat molekulları tərəfindən hücuma məruz qalırlar. Burada substrat və koferment və ya fermentin fəal mərkəzinə daxil olan amin turşusunun (bir qayda olaraq, tək amin turşusunun) funksional qrupu arasında kovalent rabitə formalaşır.

Tripsin, ximotripsin və trombin kimi serin profeazaların təsir mexanizmi məhz bu cürdür. Bu zaman fermentin tərkibinə daxil olan serin amin turşusu və substrat arasında kovalent rabitə yaranır. “Serin proteazalar” termini onunla əlaqədardır ki, serinin amin turşu qalığı bütün bu fermentlərin fəal mərkəzlərinə daxildir və katalizdə birbaşa iştirak edir. Kovalent katalizin mexanizmini zülalların onikibarmaq bağırsaqda həzmini təmin edən ximotripsinin misalında müzakirə edək. Ximotripsinin substratları qismində aromatik və tsiklik hidrofob radikallara malik (Fen, Tir,Tri) amin turşularını daşıyan peptidlər çıxış edir, bu isə ferment-substrat kompleksinin formalaşmasında hidrofob əlaqələrin iştirak etdiyini göstərir. Ximotripsinin kovalent katalizinin mexanizmi şəkil 5.9-da təsvir olunmuşdur.

Asp₁₀₂, His₅₇ və Ser₁₉₅ katalizdə birbaşa iştirak edirlər.

Substratın peptid əlaqəsinin nukleofil hücumu nəticəsində bu əlaqə parçalanır və kovalent modifikasiya olunmuş serin, yəni asilximotripsin əmələ gəlir. Digər peptid fraqmenti və ximotripsinin aktiv mərkəzinin Hiss: arasındakı hidrogen rabitənin qırılması sayəsində, bu peptid fraqmenti sərbəstləşir. Zülalların peptid rabitəsinin parçalanmasının sonuncu mərhələsində su molekulunun iştirakı ilə ximotripsinin deasilləşməsi baş verir ki, nəticədə hidroliz olunan zülalın ikinci fraqmenti də ayrılır və fermentin ilkin quruluşu bərpa olunur.

Fermentlərin təsir mexanizmini aydın göstərən misallardan biri də xolinesterazanın katalizi ilə baş verən asetilxolinin hidrolizidir (şək. 5.10). Asetilxolinesteraza hidrolazalar sinfinə aid olan və həm asetilxolinin, həm də xolinin digər efirlərinin hidrolizini kataliz edən fermentdir. Fermentin fəal mərkəzini ən azı 4 amin turşu radikalı formalaşdırır ki, bunlara Qlu, Ser, His və Tir aiddirlər. Əvvəlcə ferment (asetilxolinesteraza) və substrat (asetilxolin) arasında ferment-substrat kompleksi yaranır. Bu kompleks qlutamin turşusu radikalının mənfi yüklənmiş COOH- qrupu və asetilxolinin müsbət yüklənmiş N atomu arasında elektrostatik qarşılıqlı əlaqə hesabına yaranır. Ferment-substrat kompleksi əmələ gəldikdən sonra asetilxolinesterazanın fəal mərkəzinin digər amin turşu radikalları da prosesə cəlb olunur. Bu zaman xolinin asetil radikalının polyarlaşmış CO-qrupu və serin qalığının OH-qrupu arasında rabitə qapanır. Növbəti mərhələdə asetilxolin molekulundakı mürəkkəb efir rabitəsinin tərkibinə daxil olan oksigen və tirozin radikalının OH-qrupu arasında hidrogen rabitəsi əmələ gəlir.

Nəticədə asetilxolin molekulundakı mürəkkəb efir rabitəsinin tərkibinə daxil olan oksigen atomu ilə CO-qrupu arasında əlaqə zəifləyir, histidin radikalının təsiri altında serin radikalı ilə asetil qrupu arasında rabitə möhkəmlənir və bu da asetilxolin molekulunda mürəkkəb efir rabitəsinin qırılması ilə müşayiət olunur. Xolin fermentin fəal mərkəzindən ayrılır, onun yerini isə su molekulu tutur. O, asetil qrupun karbonil oksigeni və tirozinin oksigeni ilə rabitə əmələ gətirir, protonların yenidən paylanması baş verir və nəticədə reaksiyanın ikinci məhsulu olan sirkə turşusu ayrılır, asetilxolinesterazanın fəal mərkəzi isə bərpa olunur.

Kifayət qədər yaxşı öyrənmiş reaksiyalardan biri də yenidən aminləşmə reaksiyalarıdır. Bu reaksiya 1937-ci ildə A.E.Braunşteyn və M.H.Krisman tərəfindən aşkar olunmuşdur. Bildiyimiz kimi, yenidən aminləşmə reaksiyaları və prostetik qrup qismində piridoksalfosfat molekuluna malik olan və aminotransferazalar adlanan mürəkkəb fermentlərlə kataliz olunurlar. Fermentativ reaksiyanın mexanizmini izah edərkən, rahatlıq məqsədilə piridoksalfermenti aşağıdakı kimi işarə edəcəyik:

Fermentativ katalizin ilk mərhələsində fermentin prostetik qrupu yenidən aminləşmə reaksiyasına daxil olan amin turşu ilə qarşılıqlı əlaqəyə girir. Reaksiya, amin turşunun amin qrupu və piridiksalfosfatın aldehid qrupu üzrə gedir:

Katalizin ikinci mərhələsində substratın çevrilməsi baş verir. Bu zaman ES-kompleksində tautomer dəyişikliklər baş verir:

Bu mərhələdə baş verən tautomer yenidən qruplaşma fermentin katalitik mərkəzinə daxil olan histidin qalığının imidazol-tərkibli radikalının iştirakı ilə gedir:

Sonrakı hidroliz nəticəsində ketoturşu və piridoksamin şəklində olan ferment molekulu əmələ gəlir:

Növbəti mərhələdə piridoksaminferment və reaksiyaya daxil olan ketoturşu arasında ferment-substrat kompleksi yaranır:

Bu ferment-substrat kompleksində də substrat tautomer yenidən qruplaşmağa məruz qalır:

Yaranmış birləşmə hidrolizə məruz qalır və yeni amin turşu molekulu əmələ gəlir:

Beləliklə, mütləq olaraq ferment-substrat komplekslərinin əmələ gəlməsi ilə müşayiət olunan reaksiyalar seriyası nəticəsində asparagin turşusu oksaloasetata, o:-ketoqlutarat isə qlutamin turşusuna çevrilir. Bu reaksiya bir tənliklə də ifadə oluna bilər:

Ümumiyyətlə, piridoksal kofermentlərin iştirakı ilə gedən kataliz ferment-substrat kompleksində elektron sıxlığın dəyişməsi sayəsində baş verir:

Nəticədə amin turşu qalığının o-karbon atomundakı əvəzedicilərlə (azot, COOH-qrupu və s.) olan rabitələr zəifləyir və müvafiq rabitələrin parçalanması asanlaşır. Aspartatamino-transferaza fermentinin molekul çəkisi 93 000 Da-na bərabərdir və, o, iki identik subvahiddən ibarətdir ki, subvahidlərin hər biri piridoksalfosfat molekulu ilə birləşmiş haldadır. Aspartataminotransferaza fermentinin məhlulunu durulaşdırdıqda onun dimerləri katalitik fəal monomerlərə parçalanmış olur. A.E.Braunşteyn, Y.A.Ovçinnikov və B.K.Vaynşteynin əməkdaşları ilə apardıqları tədqiqatlar sayəsində bu fermentin birincili və üçüncülü quruluşları, eləcə də onun fəal mərkəzinin quruluşu və fəaliyyəti hərtərəfli öyrənilmişdir (şək. 5.11).

Belə ki, donuzun ürəyindən ayrılmış aspartataminotransferaza fermentinin sitozol forması 412 amin turşu qalığından ibarət olan polipeptid zəncirlə təmsil olunub. Onun əksər hissəsi o-spiral konformasiyasındadır, qlobulanın ayrıca sahəsində isə kofermentbirləşdirici domen yerləşir ki, burada fermentin fəal mərkəzi lokallaşır (şək. 5.11). Piridoksalfosfat apofermentlə zülalin lizin amin turşusunun £-amin qrupu vasitəsilə birləşir. Məhz bu aldimin rabitə ilə amin turşunun amin qrupu birləşir və lizinin s-amin qrupunu buradan sıxışdırıb çıxardır.

Aspartataminotransferaza iki subvahiddən təşkil olunduğu və piridoksalfosfatın iki qalığını daşıdığını nəzərə alsaq aydın olar ki, yenidən aminləşmə reaksiyasında subvahidlər birgə fəaliyyət göstərirlər.

Əgər ferment bir deyil, bir neçə katalitik fəallığa malikdirsə, bu halda bu fəallıqların hər birində funksional qrupların müxtəlif kombinasiyaları iştirak edir. Fermentlərin təsir mexanizminin və fəal mərkəzlərin quruluşunun, eləcə də onların xassələrinin öyrənilməsi məqsədilə spesifik inhibitorların sintez edilməsi böyük əhəmiyyət kəsb edir. İnhibitorlar fəal mərkəzə qarşı yüksək oxşarlıqla xarakterizə olunmalıdırlar və spesifik olaraq bu fəal mərkəzin müvafiq sahələrinə birləşməlidirlər.