Ouchterlony double diffusion

Aim: 

 

 

 

Principle: 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

---

RUAS  

 

Department of Biotechnology (2021-22) 

Immunology and Molecular Biology Laboratory 

The pattern of lines that form can be interpreted to determine the relationship between the 

antigens and antibodies.  

    

 

                            X                                                            Y                                                           Z 

              Pattern of Identity                         Pattern of Partial Identity  

 Pattern of Non Identity  

Fig 1:  Antigen- Antibody Patterns formed in Ouchterlony Double Diffusion  

 

Pattern of Identity: X  

Pattern of identity occurs when the antigens in the two wells are identical and specific for 

the antibody in the antiserum present in the third well. The concentration of the two 

antigens being the same, they will diffuse at the same rate resulting in a smooth line of 

precipitate. The antibodies cannot distinguish between the two antigens i.e. the two 

antigens are immunologically identical as shown in Fig 1.  

Pattern of Partial Identity: Y  

Pattern of partial identity occurs when the antigens in the two wells share some epitopes 

which are same for both, yet each of the two antigens also have unique epitopes. In this 

case antiserum contains polyclonal antibodies specific for each epitope. When one of the 

antigen has some of the same epitopes compared to other, the polyclonal antibody 

population will respond differently to the two antigens and the precipitin line formed for 

each antigen will be different. The ‘spur’ is thought to result from the determinants present 

in one antigen but lacking in the other antigen (refer to Fig 1).  

A similar pattern of partial identity is observed if the antibodies are cross reactive with an 

epitope on one of the antigen that is similar, but not identical to that present on the other 

antigen.  

Pattern of Non-Identity: Z  

Pattern of non-identity occurs when the antigens in the two wells are totally different. They 

are neither cross reactive, nor do they have any epitopes which are same. In this case the 

antiserum containing the antibodies is heterogeneous as some of the antibodies react with 

antigen in one well while some react with antigen present in the other well. So the two 

antigens are immunologically unrelated as far as that antiserum is concerned (refer to Fig 1).  

 

 

 

---

RUAS  

 

Department of Biotechnology (2021-22) 

Immunology and Molecular Biology Laboratory 

Materials Required: 

 

 

 

 

Procedure: 

 

1. 

Prepare 10 ml of 1% agarose (as given in important instructions). 

2. 

Cool the solution to 55-60

o

C and pour 5 ml/plate on to grease free glass plates placed on 

a horizontal surface.  Allow the gel to set for 30 minutes. 

3. 

Place the glass plate on the template provided. 

4. 

Punch  wells  with  the  help  of  the  gel  puncher  corresponding  to  the  markings  on  the 

template. Use gentle suction to avoid forming of rugged wells. 

5. 

Add 10 μl each of the antiserum and the corresponding antigens to the wells as shown 

in fig 2. 

6. 

Keep the glass plate in a moist chamber overnight at 37

o

C. 

7. 

After incubation, observe for opaque precipitin lines between the antigen and antiserum 

wells. 

 

                      X  

                          Y  

                Z  

       

 

 Fig 2: Template for addition of antiserum and antigen to their respective wells  

 

 

 

---

RUAS  

 

Department of Biotechnology (2021-22) 

Immunology and Molecular Biology Laboratory 

Observation: 

 

 

 

 

 

 

 

 

Result: