Ouchterlony double diffusion

Aim: 

 

 

 

Principle: 

 

 

 

 

 

 

 

                                                

 

---

RUAS  

 

Department of Biotechnology (2021-22) 

Immunology and Molecular Biology Laboratory 

Materials Required: 

 

 

Procedure: 

1.

 

2. 

3.

 

4. 

5.

 

6. 

7. 

8. 

9.

 

10.

 

Before starting the experiment the entire procedure has to be read carefully. 

Always wear gloves while performing the experiment. 

Bring all the buffers to room temperature before the assay. 

Use 24 wells per experiment. One plate can be used for 4 experiments. Don't 

reuse the same wells. 

Dilute only required amount of buffers to IX with distilled water 

before use. Blocking buffer: BSA in PBS. 

Coating buffer: Carbonate bicarbonate buffer. 

Stop solution: Sulphuric acid.

 

Preparation of IX TMB substrate: Take 0.5 ml of 10X TMB substrate and add 4.5 

ml of distilled water to it. 

Preparation of IX Wash Buffer: Take 5 ml of IOX Wash Buffer and add 45 ml of 

distilled water to it. 

Prepare the reagents as indicated below before starting of each experiment:

 

Preparation of sample diluent: Take 1 ml of blocking buffer and make up the volume to 30 mt with IX 

Wash Buffer. Use this to dilute the standard antigen and HRP labeled antibody. 

Preparation of dilutions of standard antigen: Concentration of reconstituted antigen is 0.4 mg/ml; 

dilute this to get a range of standard concentrations using sample diluent, as follows: 

No.

 

Dilutions of Standard Antigen

 

Concentration of 

Antigen 

1 

8 ul of 0.4mg/mf + 4000 ul of 

sample diluent 

800 ng/ml (a) 

2 

1000 WI of (a) + 1000 of sample 

diluent 

400 ng/ml (b) 

3 

1000 ul of (b )+ 1000 ul of sample 

diluent 

200 ng/ml (c)

 

4

 

1000 VI of (c)+ 1000 ul of sample 

diluent 

100 ng/ml (d) 

5

 

1000 pl of (d)+ 1000 WI of sample 

diluent 

50 ng/ml (e) 

6 

1000 of (e)+ 1000 pl of sample 

diluent 

25 ng/ml (f) 

7

 

1000 VI of (f)+ 1000 pf of sample 

diluent 

12.5 ng/ml (g)

 

8

 

1000 ul of (g)+ 1000 ul of sample 

diluent 

6.25 ng/ml (h)

 

---

RUAS  

 

Department of Biotechnology (2021-22) 

Immunology and Molecular Biology Laboratory