A gyógyszerhatás fizikai-kémiai alapjai Rozmer Zsuzsanna – Perjési Pál

8.4A pK_a érték meghatározásának lehetőségei

A pK_a érték meghatározására számos módszer alkalmas, amelyek alapjául az szolgál, hogy a mért analitikai jel pH-tól függő változása egyértelműen összefügg a vizsgált molekula protonleadásával, illetve protonfelvételével.
VIII- táblázat: pK_a meghatározására használt módszerek.

Módszer	Anyagigény (mg)	Szükséges oldhatóság (M)	Módszer típusa	Kapacitás (vegyület/nap)
Potenciometria	3-5	5 x 10^-4	nem HT	30-40
UV/pH titrálás hagyományos automatizált SGA	1-2 1-2 1-2	10^-5 10^-5 10^-2 (DMSO)	nem HT nem HT HT	1 30-40 200
Kapilláris elektroforézis normál mód multiplex CE	0,01 0,01	10^-5-10^-6 10^-5-10^-6	nem HT HT	20 100

8.4.1Potenciometriás titrálás

A legszélesebb körben alkalmazott, viszonylag egyszerű módszer a vegyületek savi disszociációs állandóinak meghatározására a vizes közegben végzett potenciometriás titrálás. A potenciometriás módszerrel történő pK_a meghatározás kétféleképpen történhet: direkt potenciometriás titrálással, vagy az ún. különbségi titrálással.
Direkt potenciometriás titrálás

Direkt titrálás során a vizsgálandó vegyület vizes oldatát, folytonos keverés mellett, közvetlenül titrálják a faktorozott mérőoldattal, ami vagy egy erős sav (általában sósav) vagy egy erős bázis (általában nátrium- vagy kálium-hidroxid) oldata.

A mérőoldat-fogyás függvényében kombinált üvegelektróddal folyamatosan vizsgálják és regisztrálják az elektromos jelet (mV). Az elektródot előzetesen több pufferoldat segítségével kalibrálják, így a cella leolvasott elektromotoros erejéhez tartozó feszültségértékekhez pH értékek is rendelhetők. A mért elektromotoros jelet, vagy a hozzárendelt pH értékeket a mérőoldat fogyásának függvényében ábrázolva kapják meg a potenciometriás titrálási görbét (VIII-1. ábra).

VIII-. ábra: Potenciometriás titrálási görbe


A 100%-os titráltsági értéket a görbe inflexiós pontjához tartozó fogyás jelzi. Az egyenértékpont környezetében a mérőoldatot viszonylag kis, egyenlő mennyiségekben adagolják, az eredményeket táblázatba foglalják, majd ennek alapján kiszámítjuk az első és másodfokú differencia-hányados görbe adatait. Ha a három görbét összehasonlítjuk, látható, hogy ahol az eredeti titrálási görbének inflexiós pontja volt, ott a differencia hányados görbének maximuma, a másodfokú differencia hányados görbének pedig zérushelye lesz (VIII-2. ábra).

VIII-. ábra: A potenciometriás titrálási görbe, valamint első és második differencia-hányados görbéi

Az egyenértékpont a titrálási görbe pontjainak második differenciahányadosából matematikai módszerrel – pl. a differenciahányados módszerrel – kiszámítható. Az így kapott ml-érték tehát a 100%-os titráltsághoz tartozó fogyás érték (itt teljesen deprotonált vagy protonált állapotban van a vizsgált vegyület). Adott fogyásértékek esetén számolható a titráltsági százalék értéke, ez alapján a deprotonált és protonált molekulák mennyisége, illetve aránya. A mV és pH közötti lineáris összefüggés miatt a mV értékek ismeretében pH számolható az adott fogyásértékekhez rendelten. Mindezek ismeretében a pK_a érték a fenti Henderson-Hasselbach egyenlet segítségével kiszámítható:

Az 50%-os titráltsági állapothoz tartozó pH érték az egyenlet alapján megadja a pK_a értékét, hiszen ekkor a molekula ionizált és nemionizált formája egyenlő koncentrációban van jelen. Általában a 30-70% közötti titráltsági pontokból számított pK_a értékeket átlagolva kapjuk a pontos értéket.

A módszer előnye a gyorsasága és egyszerűsége, hiszen csak egyetlen titrálást igényel. Amennyiben a vegyületnek több disszociációs állandója is van, de azok jól elkülönülnek egymástól (legalább 4 pK_a egység a különbség közöttük) használható a módszer. A pK_a értékeket azonban nem lehet ezzel a módszerrel meghatározni, ha egy molekulának több disszociációs állandója van, és azok közel esnek egymáshoz.

Különbségi titrálásos eljárás

A módszer alkalmazása során két, egymást követő titrálást kell végezni. Az első titrálás során ismert mennyiségű és koncentrációjú erős savat titrálnak ismert koncentrációjú erős lúg mérőoldattal. A második titráláskor az első titráláskor is használt, azzal azonos mennyiségű erős savhoz hozzáadják a meghatározandó anyagot, és ezt az oldatot titrálják ugyanazzal az erős bázis mérőoldattal. A két titrálási görbét egy ábrán ábrázolják (VIII-3. ábra).

VIII-. ábra: Potenciometriás titrálási görbék – a paracetamol disszociációs állandójának meghatározása különbségi potenciometriás módszerrel


A két titrálási görbe különbsége a meghatározandó vegyületről ledisszociált protonok számával arányos, ezért a két görbe különbségéből kiszámítható a disszociációs állandó értéke az ún. "H átlag" () meghatározásán keresztül. a molekuláról adott pH-n átlagosan ledisszociált protonok számát jelenti. A titrálás vége felé, bizonyos pH érték felett a két titrálási görbe lefutása párhuzamos, vagyis a különbség állandó lesz, ugyanis a vizsgált molekula ott már az összes protonját leadta. Ennek következtében ekkor egyértékű savak esetében a = 1, kétértékű savak esetében = 2, stb. Ha a konstans különbségi értéket elosztjuk a vegyületünk által leadható protonok számával, akkor megkapjuk a vegyület egy protonjára eső lúgfogyást adott mérési körülmények (bemérés, mérőoldat koncentráció) között.

A két titrálási görbe különbségéből, adott pH értéken meghatározhatók a többlet mérőoldat móljainak a száma, amit elosztva a vizsgált vegyület móljainak a számával, megkapjuk értékét.

Ugyanakkor értéke felírható a protonálódási állandó segítségével is:
Egy protonálható csoportot tartalmazó molekula esetén:

mivel:
behelyettesítve:
átrendezve:
Az egyes hidrogénion koncentrációkhoz tartozó értékekból a K protonálódási állandó kiszámítható. Több pH értéken kiszámított K értékeket átlagoljuk.
Két protonálható csoportot tartalmazó molekula esetén:

mivel: és
behelyettesítve:

Két - [H⁺] értékpár ismeretében kétismeretlenes egyenletrendszerhez jutunk, melyet megoldva megkapjuk K₁ és K₂ értékét. A kiszámolt K₁ és K₂ érték függ attól, hogy mely - [H⁺] értékpárokat használtuk a számoláshoz. A tapasztalatok azt mutatják, hogy a legpontosabb állandó értékeket akkor kapjuk, ha = 0,3 - 0,7 és = 1,3 - 1,7 értékek között van. Célszerű több - [H⁺] értékpárt is elemezni, így több K₁ és K₂ értéket is kiszámíthatunk, amelyeket átlagolva tovább pontosíthatjuk az eredményt.

A módszer nagy előnye a direkt eljáráshoz képest, hogy több disszociálódó csoporttal rendelkező, átlapoló pK_a értékekkel bíró vegyületek meghatározására is használható.

A potenciometriás mérések nagy előnye, hogy nagymértékben automatizálhatók automata titrátorok alkalmazása révén, és igen nagy pontossággal meghatározhatók a pK_a értékek. A pontosság javítása érdekében vízben jól oldódó inert sókat (pl. 0,15 M NaCl) alkalmazhatunk az állandó ionerősség beállítására. Mivel a disszociációs állandó hőmérsékletfüggő, célszerű a méréseket termosztált körülmények között elvégezni.

A potenciometriás eljárások hátránya, hogy az esetleges szennyezések (bomlástermékek, más ionizálódó szennyezők) és az oldat szén-dioxid tartalma mérési hibát okozhatnak, hiszen nem különíthetők el a vizsgált anyagtól a titrálási görbék értékelése során. Ez utóbbi kiküszöbölhető frissen kiforralt desztillált víz használatával, illetve megoldás lehet inert gáz alkalmazása a mérőcella felett.

Hátrányt jelent, hogy a titrálásokhoz viszonylag nagy ligandum-koncentráció szükséges, tehát a mérendő anyag oldhatósága is gátat szabhat a potenciometria alkalmazásának. A mérés feltétele, hogy a vizsgálandó vegyület legalább 0,5 mM koncentrációban oldódjék vízben a titrálás teljes tartományában.

Ugyanakkor potenciometriás titrálással pH 2 - pH12 tartományban lehet pontos disszociációs állandót meghatározni, hiszen az üvegelektród ebben a tartományban a legpontosabb, így az erősen savas (pK_a < 2) és az erősen bázikus (pK_a > 12) funkciós csoportok mérésekor jelentősen megnő a mérés hibája.

8.4.2UV-Vis spektrofotometriás titrálás

A potenciometriánál érzékenyebb módszer az ún. UV-pH titrálás a disszociációs állandók meghatározására. Az ultraibolya-látható (UV-Vis) spektrofotometria olyan vegyületeknél alkalmazható, melyek jelentős UV aktivitással bírnak, és a vegyület ionizálható csoportja a kromofor csoport része, illetve annak közelében található (pl. fenolát-ion, aromás gyűrű melletti karboxilát-ion vagy aminocsoport, heteroaromás gyűrű nitrogénje, stb.). Ilyen esetekben az ionizálható csoportok pH változás hatására bekövetkező protonáltsági állapotának megváltozása a spektrumban is változást okoz, vagyis protonálódás/deprotonálódás hatására a spektrum hiper- vagy hipo-, bato- vagy hipszokróm eltolódást szenved, általában a konjugáció változásának függvényében.

Így például, a 4-aminobenzoesav alapú helyi érzéstelenítők egyik képviselőjének, a benzokainnak 290 nm-nél van intenzív, analitikai meghatározást is lehetővé tévő abszorpciós maximuma. Erősen savas közegben (pH 0,6) az aromás aminocsoport protonálódása következtében azonban a vegyület spektruma már csak a benzoesav-típusú vegyületekre emlékeztet (VIII-4. ábra).

VIII-. ábra: Benzokain UV-Vis spektrumának pH-függése


Az UV-pH titrálás során a vizsgált vegyület oldatának fényelnyelését vizsgálják a pH függvényében adott hullámhosszon. Ez annyit jelent, hogy a mérés során azonos koncentrációjú és azonos ionerősségű, de különböző pH-jú oldatsorozatot kell készíteni, és minden egyes oldatnak regisztrálni kell a spektrumát. A kiértékelést legcélszerűbb azon a hullámhosszértéken megtenni, ahol a legnagyobb az y-tengely irányú (hiper- és hipokróm) eltolódás a pH változás hatására a spektrumban, tehát ahol a teljesen protonált és a teljesen deprotonált formában jelen levő komponenseket tartalmazó oldatok esetén a legnagyobb a két görbe közötti távolság.

A kiválasztott hullámhossz értéken megmérik minden oldat fényelnyelését. Az egy ionizálódó csoportot tartalmazó molekula esetén a legalacsonyabb pH-jú oldatban a molekula teljesen protonált állapotban van, a legmagasabb pH-jú oldatban pedig teljesen deprotonált formában. Az A_XH a teljesen protonált részecske, az A_X a teljesen deprotonált részecske abszorbanciája, az A_pH pedig az adott pH értéken mért abszorbancia.

A köztes pH értékeken az oldatban jelen levő protonált részecskék mennyiségét az A_X-A_pH különbség, a deprotonált részecskék mennyiségét az A_pH-A_XH különbség fejezi ki. A Henderson-Hasselbach egyenlet felhasználásával a pK_a érték számolható:

Az UV-pH titrálást elsősorban olyan vegyületek disszociációs állandóinak meghatározására használják, melyek kis oldhatósága nem teszi lehetővé a potenciometriás meghatározást. Az UV-pH titráláshoz ugyanis, a vegyület fajlagos abszorpciós koefficiensétől függően, általában 50 µM koncentrációjú oldat elégséges a méréshez.

A módszer automatizálható, ilyenkor a titráló berendezéshez közvetlenül csatlakoztatnak egy diódasoros spektrofotométert, lehetővé téve azt, hogy minden egyes mérőoldat adagolást követően a pH méréssel egyidejűleg megtörténik a minta spektrumának a felvétele is. Így jelentősen lerövidül egy vegyület pK_a értékének meghatározása.

8.4.3Egyéb módszerek

A spektrális grádiens analízis (SGA) módszer

Az ún. spektrális grádiens analízis („spectral gradient analysis”, SGA) nagy áteresztőképességű pK_a meghatározó eljárásnak tekinthető. A vizsgálat során savas és bázikus puffer oldatok elegyítésével időben lineáris pH-grádienst állítanak elő. A mintát az áramló pufferbe injektálják, és diódasoros UV detektorral regisztrálják a pH változásra bekövetkező spektrumváltozást. Egyetlen pontból, 4 perc alatt kielégítő megbízhatósággal nyerhető pK_a adat.

Kapilláris elektroforézis
A kapilláris elektroforézis viszonylag új lehetőség a pK_a érték meghatározására. A meghatározás során a vizsgálandó vegyület látszólagos elektroforetikus mozgékonyságát határozzák meg, amely kapcsolatban áll a kapilláris hosszával, a vándorlási idővel és az alkalmazott feszültséggel. Ugyanakkor egy ionizálható vegyület elektroforetikus mobilitása függ az adott pH értéken jellemző ionizáltsági állapotától. A látszólagos mobilitási értékeket a pH függvényében ábrázolva egy szigmoid görbét kapunk, amelynek inflexiós pontja megfelel a vegyület pK_a értékének.

A módszer igen nagy előnye a kis anyagigénye és a szelektivitása. Nem igényel nagy tisztaságú mintát, hiszen főként elválasztástechnikai módszerként használják.

Egyéb lehetőségek
További lehetőséget nyújt a disszociációs állandó meghatározására az NMR - pH titrálás, valamint a CD-pH titrálás. Ezek a módszerek egyelőre nem rutin technikák, speciális problémák - főként más módszerrel nem mérhető vegyületek esetén - megoldására használatosak.

Az NMR-pH titrálás során a protonálódásban részt vevő csoport(ok) közelében levő NMR aktív magok kémiai eltolódását vizsgálják a pH függvényében. A módszer előnye, hogy nem igényli a mérendő anyag pontos koncentrációjának ismeretét, és esetleges szennyezők sem zavarják a meghatározást.

Vízben nem oldódó vegyületek pK_a értékének meghatározása
A vízben rosszul oldódó vegyületek pK_a meghatározása az eddig felsorolt módszerekkel nehézkes. A potenciometriás módszer feltétele, hogy a vegyület a titrálás teljes pH-tartományában oldott formában legyen jelen. Ha ez nem valósul meg, de a vegyület spektrális tulajdonságai azt lehetővé teszik, akkor a spektrofotometriás módszer alkalmazható, hiszen kisebb vízoldhatóság is elegendő.

Amennyiben a vegyület vízben nem oldódik, úgy a pKa meghatározására a leginkább elterjedt megoldás az oldószerelegyben („co-solvent method”) való mérés, mind a potenciometriás, mind a spektrofotometriás eljárás során. A szerves oldószer - víz elegyekben, amelyek közül a leggyakrabban a metanol/víz-rendszer használatos, meghatározzák az ott érvényes ún. látszólagos ionizációs állandót (p_sK_a), majd extrapolálnak a nulla szerves oldószer tartalomra, vagyis vizes közegre.