Guruh talabasi ning biorganik kimyo fanidan amaliy mashg’uloti namangan 2023

4-Mavzu: RNK va DNK larni tozalash, ishqoriy va kislotali gidrolizlari. Gidroliz mashsulotlarining tarkibini (purin, pirimidin asoslari) xromatografiya yordamida o`rganish


1-ish
DNK-ning kislotali gidrolizi va xromatografiya yordamida nukleotid tarkibini aniqlash
Ishning umumiy izoshi. DNK-ni HClO₄ –ning 72%-li aralashmasi bilan gidrolizlanadi va gidrolizatni silikagelli yupqa qatlamda xromatografiya qilinadi, asoslarning rangli dog`larini ajratib olinadi va asoslarning miqdorini va nukleotid tarkibini aniqlanadi.
Jihozlar va reaktivlar. 2 M DNK, 72%-li HClO<sub>4</sub>, gidroliz uchun ampula, 100 S-li termostat yoki suv shammomi, xromatografiya kamerasi, SF-26, yupqa silikagel’ qatlamli xromatogrfiya qog`ozi.
Ishning borishi. 2 mg DNK-ni oz miqdordrgi 72%-li HClO₄ bilan (DNK cho`kmasi kislotaga shimdirilsin) bir soat davomida 100 S-da (suv shammomida) berkitilgan ampulada gidrolizlanadi. Gidrolizdan keyin, ampula ochiladi va gidrolizatni kerak bo`lgachda 1-2 tomchi suv bilansuyultiriladi va yupqa silikagelli qavatlarda xromatografiya qilinadi. YUqorida ko`rsatilgan sharoitda DNK ozod asoslargacha, ribozagacha (furfurolga aylanadi) va fosfat kislotaga gidrolizlanadi. To`yingan (NH₄)₂SO₄ : 1 M NaCOOCH₃ : i-propanol  80:18:20 sistemasida xromatografiya qilinganda asoslar quyidagicha taqsimlanadi: (boshlangich nuqtaga nisbatan) guanin, adenin, timin, tsitozin. 5 mM HCl ishlatilganda asoslarning taqsimlanishi o`zgarmaydi, ya`ni guanin, adenin, timin, tsitozin, ammo timin tsitozindan yaxshiroq ajralib chiqadi.
Metanol : konts. HCl : suv  7:2:1 sistemasida qogoz xromatografiyani ishlatilsa yaxshi natijalarga erishish mumkin. Pastga yo`naluvchi qogoz xromatografiyasida asoslar quyidagicha joylashadi: guanin, adenin, tsitozin va timin.
Xromatogrammani issiq shavoda quritiladi va UB-nurida kuzatilib, qalam bilan asoslarning dog` chegaralarini belgilanadi, silikageldagi yoki qog`ozdagi shar bir dogni 5-6 ml 0,1 n HCl bilan yuviladi. Yuvib olishni tezlatish uchun qog`ozni mayda-mayda qilib qirqiladi va yuvishni bir qancha vaqt davomida 37-45 C-da olib boriladi.
YUvib olingan eritmalarni shisha filtrdan o`tkaziladi va optik zichligi o`lchanadi: guanin 250 va 290 nm-da, adenin 260 va 290 nm-da, tsitozinin 276 va 290 nm-da, timin 260 va 290 nm-da. O`simliklardan olingan DNK-ni o`rganishda xromatogrammalarda tsitozin va timin dog`lari orasida yana bir chiziq shosil bo`ladi: u 5-metiltsitozinga to`g`ri keladi. 5-metiltsitozinga to`g`ri keladigan ekstraktni 280 va 300 nm-da tekshiriladi. Olingan optik zichliklarga ko`ra asoslarning miqdori quyidagi formula bo`yicha mkmollarda aniqlanadi: G  0,714  (E₂₅₀-E₂₉₀), A  0,399  (E₂₆₀-E₂₉₀), TS  0,940  (E₂₇₆-E₂₉₀), 5-MTS  0,893  (E₂₈₀-E₃₀₀) va T  0,743  (E₂₆₀-E₂₉₀). Har bir asosning molyar protsenti shisoblab (shar bir asosning mkmollar yig`indasi 100% deb olinadi) chiqariladi. Natijalar jadval ko`rinishida rasmiylashtiriladi
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________