O‘zbekiston respublikasi o liy ta’lim, fan va innovatsiyalar vazirligi qarshi davlat universiteti qo‘lyozma huquqida udk

Reaktivlar ro’yxati
Miqdori
Suv (ster.)	13.8 mkl
10x PZR buferi	2 mkl
dNTP	0.6 mkl
Har bir praymerdan	1.5+1.5 mkl
Taq-polimeraza	0.6 mkl
Jami:	20 mkl

PZR quyidagi sxema bo’yicha amalga oshirildi: 1 – bosqich – 3 daqiqa davomida DNK ning 95^°S sharoitda denaturasiyalanishi, 2 – bosqich – DNKning 93^°S sharoitda 20 soniya davomida denaturasiyalanishi, 3 – bosqich – DNKda 55^°S sharoitda 30 soniya davomida praymerlarning yopishishi, 4 – bosqich – 72^°S sharoitda 2 daqiqa davomida elongasiyalanish, 5 – bosqich – 72^°S sharoitda 10 daqiqa davomida zanjirning elongasiyalanishi. Ikkinchidan to’rtinchi bosqichgacha jarayon sikl ko’rinishida 35 martagacha takrorlangan (2.3.3-jadval).

2.3.3-jadval
PZR belgilangan harorati va vaqti

Reaksiya (Dastur)	Bosqich	Harorat (°S), bosqich sikli		Vaqt
I	Dastlabki Denaturasiyalanish	95		5 daqiqa
	Denaturasiya	93	45 sikl	45 soniya
	Yakunlash	54		45 soniya
	Elongasiyalanish	72		2 daqiqa
	Zanjirni tugatish	72		10 daqiqa

Agaroza gelida elektroforez usuli. Polimeraza zanjir reaksiyasi tugaganidan so’ng gel’elektroforez usulidan foydalanildi. Bu usul - analitik metod bo’lib, ajratish, tenglashtirish va DNK qismlarini tozalash uchun foydalaniladi. DNK elektroforezi gorizontal yo’nalishda amalga oshiriladi.
Gelning tarkibiga quyidagilar kiradi: 1X TAE (rN 8,1), agaroza, bromli etidiy. Agaroza gelini tayyorlash va PZR mahsulotlarida elektroforez o’tkazish uchun quyidagi ketma - ketlikda amalga oshirildi. Gelni elektroforez vannachasiga qo’yishdan avval namunalarni kiritish uchun plastinka-oynali taroqchalarni o’rnatib chuqurchalar (lunka) yasab olindi. Taroqchalarning pastki tishchalari umumiy hajmi 50 ml bo’lgan gelning asosidan 2 mm oralig’ida joylashtirildi (umumiy hajmi 150 ml bo’lgan gelning asosidan 1mm oralig’ida joylashtirilgan).
50 ml 2% li agaroza gelini tayyorlash uchun 50 ml 1X TAE va 1g agaroza qo’shildi. 1X TAE boshlang’ich konsentrasiyasi 50X TAE eritmasidan tayyorlanadi (Tris, 0,5M EDTA pH8,0, muzlatilgan sirka kislotasi). Kolbaga solingan agarozali TAE aralashmasini gomogen holatiga kelguncha qizdiriladi (eritmada agarozaning erimagan zarralarini bo’lmasligi lozim). Bu jarayondan so’ng 50°S darajasida sovutildi va 0,5 mkl bromli etidiy qo’shildi. Hamma gel hajmi elektroforez vannachasiga quyildi. Gel sovugandan so’ng (30-45 daqiqa xona haroratida), sekinlik bilan taroqchalarni olib tashlandi va elektroforez vannachasiga 1X TAE buferini gel to’liq qoplaganicha quyildi. 10-15 daqiqadan so’ng chuqurchalarning (lunka) biriga 2,5 mkl li DNK-markerini DNA Ladder 100pb (Promega) qo’shildi.
DNK ajratishi uchun kuchlanish 1 santimetr gelda 5 voltdan oshmasligi zarur. 40-45 daqiqadan so’ng gelni ultrabinafsha va transillyuminator nurlarida ko’rildi va rasmga olindi, natijalar qayd qilindi.