P. Mirxamidova, A. H. Vaxobov, Q. Davranov, G. S. Tursunboeva

13.3. Fermentlarni tozalash usullari
. 
Fermentlar va boshqa oqsil moddalar adsorbsiyalanish (so‘rilish) 
qobiliyatiga egalar. Bu xususiyat oqsil aralashmalarini birikmalarga ajratishda va 
ayniqsa fermentlarni laboratoriya sharoitida tozalashda, hamda bo‘lgan ferment 
preparatlarini gomogen holatda olish jarayonlarida keng ishlatiladi. Adsorbsiya 
usuli, shu bilan birga kolonkali xromatografiya usullari fermentlarni yuqori 
darajada toza va ko‘p miqdorda olish imkonini beradi. 
Oqsillarning va fermentlarni tozalash, ularni bir-biridan ajratish maqsadida 
maxsus adsorbentlar hap xil ion almashuvchilar, polisoxaridlar asosida 
tayyorlangan sefadekslar va ularni xosilalari, sellyuloza va ularni xosilalari, 
anionlar va kationit ko‘rinishda, ba’zida kalsiy fosfat, alyuminiy gidroksid gellari 
va mba’zi-bir fermentlar uchun affinli adsorbentlar tayyorlangan va ular ishlab 
chiqarishda hamda laboratoriya tadqiqotlarida samara bilan ishlatib kelinmoqda. 

---

 184 
Fermentlarni tozalash va oqsillarni ajratish texnologiyasi qanday tipdagi usulda 
bo‘lishiga qaramay quyidagilarga asoslanadi: ferment mahsulotini o‘z tarkibiga 
olgan oqsillar aralashmasi ma’qul bo‘lgan erituvchida (buferda) eritiladi va shu 
erituvchi bilan muvozanatlangan kolonkaga yuboriladi. Keyin shu kolonkadan 
ma’lum tarkibga ega bo‘lgan buferni yoki konsentratsiyasi o‘sib boruvchi 
gradientli yuvish eritmasi, yoki bo‘lmasa ushbu ferment uchun maxsus bo‘lgan 
bog‘lovchi (ligand) yordamida, korakli oqsil (ferment) bosqichma-bosqich yuvib 
olinadi. Kolonkadan yuvib olingan ferment preparatlari fraksiyalar to‘plamida 
yig‘iladi va fermentni toza preparatini olish uchun boshlang‘ich material bo‘lib 
xizmat qiladi. 
Ionalmashuv xromatografiya usuli
.
 
Bu usulda oqsillar elektrostatik kuch 
yordamida bog‘lanadilar, ya’ni bu hodisa zaryadlangan oqsil sirtlari va 
zaryadlangan ionalmashuv birikma guruhlarining zich qatlami o‘rtasida yuzaga 
keladi. Tipik ionalmashuvchi sifatida bo‘ktirilgan dietilaminoetil (DEAE-) yoki 
karboksimetil (KM) sellyulozani ko‘rsatish mumkin. Ular bo‘ktirilgan holatda, 
zaryadli guruhlarning 0,5 M konsentratsiyasiga ega bo‘ladi. Bu zaryadlap 
kolonkada qapama-qarshi bo‘lgan ionlarni (metall ionlari, xlor ionlari, bufer va 
h.k.) neytrallaydi. Odatda oqsilning umumiy zaryad belgisi ion almashuvchiga 
o‘tirgan ion belgisi bilan bir xil bo‘ladi va kolonkadan o‘tish jarayonida aynan uni 
siqib chiqaradi. Shuning uchun ham bu jarayon xususiyatiga qarab “ion 
almashuv” jumlasi qo‘llaniladi. 
Kolonkada adsorbsiyalangan kepakli oqsilni yuvish uchun affin usulidan
tashqari ikki usuldan foydalaniladi. Birinchi usul - buferning rN ko‘rsatkichini 
ma’lum darajaga o‘zgartirish bilan ion kuchini oshirib, adsorbent va oqsil 
o‘rtasidagi elektrostatik o‘zaro ta’sirni kamaytirishdir. Bu usul umuman yaxshi 
natija bermaydi. Chunki bufer hajmini kichik bo‘lganligi uchun 
rN
ko‘rsatkichini birdaniga o‘zgar-tirish oqsil aralashmalariga va boshqa 
birikmalarning yomon ajralishiga sabab bo‘ladi. 1981 yilda bu usul 
L.L.Slyuyterman va boshqalar tomonidan xromatofokus usuliga o‘tkazish yo‘li 
bilan takomillashtirilgan. Bunda, fermentlarni asorbentdan yuvib olish jarayonida 
amfolit tipidagi bufer hajmi yuqori bo‘lgan buferlardan foylalaniladi.
Ikkinchi usul keng miqyosda foydalanilayotgan kaliy yoki natriy xlorid 
tuzlari yordamida gradient tuzishga asoslangan. Tuz ionlari ishtirokida mustaqil 
oqsil va adsorbentlar orasidagi o‘zaro tortish kuchi kamayadi. Tuz ionlari 
konsentratsiyasini oshishi bilan adsorbentga bog‘langan oqsillar o‘z o‘rinlarini 
ularga bo‘shatadilar va o‘zlari kolonkadan yuvilib chiqa boshlaydilar. Shu bilan 
birga tuz ionlari ta’sirida adsorbentlar o‘zaro yaqinlashib oqsil harakati uchun tor 
yo‘lkalar hosil qiladi va bu hodisa fermentlarni kolonkadan chiqishida 
fraksiyalarga ajratib olish imkonini beradi. 
Ion almashuvchiga bog‘langan fermentni affinli yuvish yordamida ajratish 
mumkin. Buning uchun kolonkaga oqsil bilan bog‘lanadigan maxsus ligand 
yuboriladi. Bunda oqsil, ligand bilan birgalikda tezda kolonkadan yuvilib chiqadi. 
Lekin kerakli oqsilni taniydigan va uni sorbentdan ajratib oladigan ligandni topish 
juda mushkul vazifadir. Shu bilan birga ligandni qanday zaryadlanganligi va 

---

 185 
konsentratsiyasiga alohida e’tibor berish kerak. Agar shunday qilinsa, ligandni o‘zi 
ionalmashuvchiga bog‘lanib qolishi mumkin. 
Affinli xromatografiya usuli
.
 
Bu usul oqsil va fermentlarni tozalash va 
ajratishning adsorbsiya hodisasiga asoslangan usullari orasida alohida o‘rinni 
egallaydi. Ko‘pincha uni affinli xromatografiya yoki bioaffinli yoki bo‘lmasa, 
biospetsifik xromatografiya deyiladi. 
Ma’lumki, barcha biologik faol birikmalar, xususan fermentlar ham 
ligandlar yoki affinli ligandlar deb nomlanadigan birikmalarga maxsus bog‘lanish 
xususiyatlariga egadir. Agarda shunday ligandlarni inert matritsaga kovalent 
bog‘lasa faqat kerakli fermentni ushlovchi va qolgan oqsil va moddalarni o‘tkazib 
yuboruvchi maxsus adsorbentni olish mumkin. 
Maxsus yuvuvchilardan yoki jarayon sharoitlarining farqi asosida, ligandni 
fermentga bo‘lgan xususiyatini o‘zgartirish yo‘li bilan oqsilni desorbsiyaga 
uchratib, tozalash natijasida, yuqori tozalikka ega bo‘lgan fermentni ajratib olish 
mumkin bo‘ladi. Lekin ligand va uni ushlab turuvchini tanlash juda qiyin vazifadir. 
Ko‘pchilik hollarda affinli adsorbentlarni sintez qilishda tozalanayotgan 
fermentning xususiyatlarini e’tiborga olish kerak. Affinli xromatografiya uchun 
har xil turdagi erimaydigan sorbentlardan foydalanadi, lekin eng ko‘p tarqalgani 
ko‘ndalang qilib ulangan agaroza donachalaridir. Ular yuqori bosimda o‘z shaklini 
saqlaydi va buferlarni hamda erituvchilarni almashtirishga bardoshlidir. 
Ligandlar esa matritsaga shunday bog‘langan bo‘lishi kerakki, oqsillar hech 
qiyinchiliksiz ularga kelib bog‘lanishi mumkin bo‘lsin, buning uchun esa matritsa 
bilan ligand o‘rtasida ko‘prikcha bo‘lishi kerak. Bulardan tashqari ligand boshqa 
birikmalar bilan o‘zaro bog‘lanmasligi, fakat matritsaga bog‘langan va yuvish, 
regeneratsiya jarayonlariga chidamli bo‘lishi shartdir. 
Gelxromatografiya usuli
. 
Gelfiltratsiya jarayonini amalga oshirish uchun 
dekstran asosida olingan gellardan foydalaniladi va ular yordamida razmeriga 
qarab har xil makromolekulalarni tez ajratish mumkin. Gel ochiq holdagi 
ko‘ndalang tikilgan uch o‘lchamli molekula turi bo‘lib, kolonkalarni oson 
to‘ldirish uchun yumaloq donachalar (granula) ko‘rinishida bo‘ladi. Donachalarda 
kichik teshikchalari bo‘lib, ularga faqat juda kichik molekulali birikmalar kiradi va 
yirik molekulalar esa kirmaydi. Bu usul gellarning aynan shu xususiyatiga 
asoslangandir. 
Bu usul fermentlarni tozalash va ajratishda nafaqat laboratoriya, balki 
sanoat miqyosida ham keng qo‘llaniladi. Gelfiltratsiya uchun ko‘ndalang tikilgan 
dekstran (sefadekslar va sefakrillar) gellaridan, ko‘ndalang tikilgan poliakrilamid 
gellaridan (biogellar), akrilamid polimer zanjiri yopishtirilgan agaroza gellardan 
(ultragellar) va b. agaroza gellaridan foydalaniladi. 
Kolonkada ferment eritmasining bir qismi gel donachalar orasida va bir 
qismi esa donachalarning teshikchalari ichida joylashadi. Gelfiltratsiya – bu 
tarqaluvchan xromatografiyaning bir shakli bo‘lib, eritilgan moddalar eritmaning 
bir muncha yuzada joylashgan harakatchan va ichki tomonida joylashgan kam 
harakatli qismlarida tarqalgan bo‘ladi. Kolonkada eritilgan moddaning ushlab 
qolinish darajasi uning gel teshikchalariga kira olish qobiliyatiga bog‘liqdir. 
Shuning uchun gelfiltratsiya jarayonida kolonkadan avval yuqori molekulali 

---

 186 
moddalar va keyin esa kichik molekulalilari birin-ketin chiqa boshlaydi. Bunda gel 
molekulyar to‘r vazifasini bajaradi. Bu jarayon ideal ravishda olib borilishi uchun 
gel tayyorlangan material erigan birikmalar ta’siriga juda ham inert bo‘lishi kerak. 
Afsuski bugungi kunda ishlatilayotgan barcha gellar inert emas va ba’zan ma’lum 
pN ko‘rsatkichida ular so‘rish (adsorbsiya qilish) qobiliyatini namoyon qilishi 
mumkin, masalan, shunday gellarga sefakrillarni kiritish mumkin. Gelfiltratsiya 
usuli bilan mayda gel donachalarida yuqori bosim ostida juda ko‘p har xil 
moddalarning, shu jumladan oqsillarning aralashmalari ajratilmoqda. Bu yangi, 
“yuqori bosim ostida suyuq xromatografiya uslubi” qisqa vaqt ichida fermentlarni 
yuqori darajada tozalash imkonini berdi va u ayniqsa fermentlarni tozalashning 
oxirgi bosqichlarida juda katta samara bilan ishlab kelinmoqda.