Biotexnologiya kafedrasi

Мавзу: Рекомбинат ДНК технологияси

Режа:

2. 
   Рекомбинат ДНК технологияси
   
3. 
   Рекомбинант ДНК олиш усулларини айтиб беринг?
   
4. 
   Генларни клонлаш
   

Сунъий шароитда рекомбинант ДНК олиш ва генларни клонлаш илк бор 1972 йилда АҚШ олимлари Бойер ва Коэн томонидан амалга оширилган. Бу олимлар E.coli бактериясининг хромосома ДНК сига ва шу бактерия плазмидасига алоҳида идишларда EcoRI рестриктаза ферменти билан ишлов берганлар. Плазмида таркибида фақат 1 дона EcoRI рестриктаза ферменти таниб кесадиган махсус нуклеотидлар кетма-кетлиги бўлганлиги сабабли фермент плазмиданинг халқасимон ДНК қўш занжирини фақат бир жойдан кесиб, плазмидани «ѐпишқоқ« учли очиқ ҳолатга ўтказади. Хромосома ДНК молекуласида EcoRI рестриктаза ферменти таний оладиган махсус нуклеотидлар кетма-кетлиги қанча бўлса, бу молекула шунча бўлакка бўлинади.

Турли хил ўлчамга эга бўлган ДНК молекуласи электрофорез услуби ѐрдамида ажратиб олинади. Ажратиб олинган «ѐпишқоқ» учли хромосома ДНК си бўлаги очиқ ҳолатдаги ―ѐпишқоқ‖ учли плазмида ДНК си билан аралаштирилиб лигаза ферменти ѐрдамида тикилади (уланади). Натижада плазмида таркибига хромосома ДНК бўлаги киритилади.
Шу боисдан рекомбинант ДНК га қуйидагича тариф бериш мумкин: ҳар қандай тирик организм ирсий молекуласининг исталган бўлагини вектор молекулаларига бирикишдан ҳосил бўлган сунъий ДНК - рекомбинант ДНК дейилади.
Рекомбинант ДНК олишнинг учта усули мавжуд:

• 
  коннектор усули;
  
• 
  рестриктаза-лигаза;
  
• 
  линкер молекулаларидан фойдаланиш усули.
  

Коннектор усулида - рекомбинацияда иштирок этувчи ДНК бўлагининг 3' учига дезоксинуклеотидил-трансфераза ферменти ёрдамида маълум узунликдаги олиго (dA) - сегменти уланади. Иккинчи учига эса олиго (dT) - сегменти уланади. Бу ДНК бўлаклари аралаштирилганда dA ва dT сегментларнинг водород боғлари асосида комплементар бирикиши туфайли халқасимон ДНК структураси ҳосил бўлади. Ҳосил бўлган ДНК даги бир занжирли бўш жойлар ДНК-полимераза I ферменти ёрдамида тўлдирилади.
Рестриктаза-лигаза усули - рекомбинант ДНК олишнинг энг содда ва осон усули ҳисобланади. Бу усулда ДНК молекуласи ва вектор плазмида
«ёпишқоқ» учлар ҳосил қилувчи рестриктаза билан қирқилади ва аралаштирилган ҳолда маълум шароитда реассоциация қилинади. Комплементарлик хусусиятига кўра ДНК молекулалари ўзаро водород боғлари ёрдамида бирикиб халқасимон структура ҳосил қилади ва
ДНК занжирининг бирикмаган жойлари ДНК-лигаза ферменти ёрдамида уланади.
Линкер молекулаларидан фойдаланиш усулида - ДНК молекуласига ва вектор плазмидага Т4 фаг ДНК-лигаза ферменти ёрдамида махсус нуклеотид кетма-кетлигига эга бўлган линкер молекула уланади. Олинган икки турдаги ДНК молекуласи рестриктаза ферменти ёрдамида қирқилиб, аралаштирилган ҳолда қайтадан ассоциация қилинади. ДНК ва вектор плазмида молекулаларининг бирикмаган жойлари ДНК-лигаза ферменти ёрдамида уланади. Шу йўсинда рекомбинант ДНК молекуласи ҳосил бўлади.