Ouchterlony double diffusion

Particulars 

Marks 

Maximum 

Actual 

Conduction of Experiment 

 

10 

 

Write up 

 

05 

 

Observation and Result 

 

05 

 

Viva 

 

05 

 

Total 

 

25 

 

 

 

 

 

Signature of Staff Incharge 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

---

RUAS  

 

Department of Biotechnology (2021-22) 

Immunology and Molecular Biology Laboratory 

Experiment 3 

SINGLE RADIAL IMMUNODIFFUSION  

 

Introduction: 

Single Radial Immunodiffusion, also known as Mancini technique, is a quantitative immunodiffusion 

technique used to detect the concentration of antigen by measuring the diameter of the precipitin 

ring formed by the interaction of the antigen and the antibody at optimal concentration. In this 

method the antibody is incorporated into the agarose gel whereas the antigen diffuses into it in a 

radial pattern. 

 

Aim: 

 

 

Principle: 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ab In gel 

 

 

 

Ag Concentration

 

Fig 1: In Single Radial Immunodiffusion assay the diameter of the precipitin 

ring increases with increasing concentration of the antigen

 

---

RUAS  

 

Department of Biotechnology (2021-22) 

Immunology and Molecular Biology Laboratory 

Materials Required: 

 

 

 

Procedure: 

1 .

 

2. 

3.

 

4. 

5.

 

6. 

7. 

8.

 

Before starting the experiment the entire procedure has to be read carefully. 

Always wear gloves while performing the experiment. 

Preparation of IX Assay Buffer: To prepare 10 ml of IX Assay Buffer, add 1 ml of 

10X Assay buffer to 9 ml of sterile distilled water. 

Preparation of 1% Agarose gel: To prepare 10 ml of Agarose gel, add 0.1 g of 

Agarose powder to 10 ml of IX Assay Buffer, boil to dissolve the agarose 

completely. 

Wipe the glass plates with cotton; make it grease free using alcohol for even 

spreading of 

agarose. 

Cut the wells neatly without rugged margins. 

Add the antiserum to agarose only after it cools down to 55 

0 

C as higher 

temperature will inactivate the antibody. 

Ensure that the moist chamber has enough wet cotton to keep the 

atmosphere humid. * Molecular biology grade water is recommended 

(Product code: ML024). 

 

 

 

1.  Prepare 10 ml of 1% agarose gel (as give in the important instructions). Take 6 ml of this gel 

solution in a clean test tube. 

2.  Allow the solution to cool down to 55-60

0

C and add 80 gl of antiserum to 6 ml of agarose 

solution. Mix well for uniform distribution of the antibody. 

3.  Pour agarose solution containing the antiserum on to a grease free glass plate placed on a 

horizontal surface. Allow the gel to set for 30 minutes. 

4.  Place the glass plate on the template provided. 

5.  Punch wells with the help of gel puncher corresponding to the markings on the template. Use 

gentle suction to avoid forming rugged wells. 

6.  Add 10 of the given standard antigen and test antigen samples to the wells. 

•  Standard Antigen A (3.75 mg/ml) 

•  Standard Antigen B (7.5 mg/ml) C. Standard Antigen C (15 mg/ml) D. Standard Antigen D 

(30 mg/ml) 

•  Test Antigen 1 

• 

Test Antigen 2

 

 

---

RUAS  

 

Department of Biotechnology (2021-22) 

Immunology and Molecular Biology Laboratory 

                                                               

 

     Fig 2: Template for pattern of wells for loading of standard and test antigens 

 

7.  Incubate the glass plate in a moist chamber overnight at 37

0

C. 

 

Observation and Graph: 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Result: