A gyógyszerhatás fizikai-kémiai alapjai Rozmer Zsuzsanna – Perjési Pál

6.2Affinitás és aktivitás

Amint azt az enzim-szubsztrát kölcsönhatás kvantitatív összefüggései kapcsán bemutattuk, a másodlagos kölcsönhatáson alapuló szubsztrát koncentráció - reakciósebesség összefüggés telítési görbét mutat (III-1. ábra). Hasonló kísérleti tapasztalatok voltak nyerhetők az agonista koncentrációja és a mérhető biológiai válasz nagysága közötti összefüggés vizsgálata során. Amennyiben a ligandumot fokozatosan növekvő koncentrációban adjuk a receptorhoz, a kiváltott válasz mérteke először lassan, majd egyre meredekebben emelkedik, majd egy bizonyos koncentráció fölött már nem növelhető tovább.

Ugyanazon a receptoron kötődő agonista vegyületek (ligandumok) összehasonlítása során megállapítható volt, hogy az egyes agonisták által kapott biológiai válasz nagysága különbözőségeket mutatott. Egyes agonisták alkalmazása eredményeképpen a biológiai válasz nagysága elérte az endogén agonista alkalmazásakor mérhető maximumot, más agonisták esetén azonban a maximális válasz nagysága kisebb volt annál (VI-3. ábra). Ez esetben a maximális választ adó agonistát teljes agonistának, az annál kisebb nagyságú (maximális) biológiai választ eredményező agonistát részleges agonistának nevezzük. Az agonisták biológiai hatását gátló vegyületeket összefoglaló néven antagonistáknak hívjuk.

VI-. ábra: Teljes és részleges agonista dózis-válasz görbéi.

A dózis–biológiai válasz összefüggések ábrázolására a lineáris koordinátarendszer helyett gyakran fél-logaritmusos ábrázolást választunk, amikor az x tengelyen a koncentráció (dózis) logaritmusát ábrázoljuk. Ekkor a dózis-válasz görbék jellegzetes szigmoid alakot öltenek, melyről leolvasható a ligandum hatékonysága (ED₅₀), vagyis a fél-maximális hatáshoz szükséges ligandum dózis, illetve a hatáserősség (E_max), amely a maximálisan kiváltható válasszal egyenlő (VI-4. ábra).
VI-. ábra: A dózis-biológia válasz összefüggés lineáris és szemilogaritmikus koordinátarendszerben történő ábrázolása.


A vizsgálatok későbbi szakaszában, a receptorok (célmolekulák) azonosítása és izolálását követően kezdődtek meg azok a munkák, melyeknek az agonisták és az antagonisták biológiai válaszreakcióinak vizsgálatán túlmenően a vegyületek és a receptorok kölcsönhatásának vizsgálata. Izotópjelzett vegyületekkel végzett kötődési vizsgálatok segítségével megállapítható volt, hogy mind az agonisták mind az antagonisták a legtöbb esetben reverzibilis kötést alakítanak ki a receptorokkal, ami az egyensúlyra vezető reakciókra alkalmazható tömeghatás törvénye alapján definiált egyensúlyi disszociációs konstans (K_D) értékével jellemezhető.

Ahol K_D = a disszociációs konstans

[L] = a szabad ligandum egyensúlyi koncentrációja

[R] = a szabad receptor egyensúlyi koncentrációja

[LR] = a ligandum-receptor komplex egyensúlyi koncentrációja.

A disszociációs konstans (K_D) számszerű értéke nem más, mint az a ligandum-koncentráció, ahol a ligandum a kötőhelyek 50%-át foglalja el. Minél kisebb a K_D értéke, annál erősebb a ligandum(L)-receptor(R) kölcsönhatás.
Igazolható, volt, hogy a receptorok – az enzimekhez hasonlóan - véges számú kötőhellyel rendelkeznek, melyek különböző koncentrációban jelenlévő agonista vagy antagonista vegyülettel telíthető. E vizsgálatok alapján definiálható volt az agonista/antagonista vegyületek adott receptorral szemben mutatott termodinamikai affinitása. A nagy affinitású (kis K_D értékkel bíró) vegyületek kisebb koncentrációk esetén képesek telíteni a rendelkezésre álló aktív helyeket, mint a kis affinitású (nagy K_D értékkel bíró) vegyületek. Az azonos helyen kötődő ligandumok affinitásának erősségét a dózis-válasz görbe X tengelyhez viszonyított helyzete (ED₅₀) határozza meg.

A kísérletek során a képződő receptor-ligandum komplexek termodinamikai stabilitása mellett azok kinetikus stabilitása is. Ha a ligandumok kicserélődése lassan megy végbe a komplexeket kinetikailag inert, ha a szabad ligandum gyorsan kicserélődik a komplex ionban kötöttel, a komplexet kinetikailag labilis komplexnek nevezzük.

A dózis-biológiai válasz görbék kvantitatív (a kötődési és a biológiai vizsgálatok eredményei közötti kapcsolat) elemzésével először J. Langley, A. Hill és A. Clark foglalkozott. Munkáik eredményeképpen született meg a gyógyszer-receptor kölcsönhatás ún. telítési elmélete. Az elmélet első kidolgozója A. Clark volt, aki a gyógyszer-receptor kölcsönhatást az egyensúlyok tanának tömeghatás törvénye alapján értelmezte. Értelmezése szerint a biológiai hatás nagysága egyenesen arányos az agonista-receptor komplexek számával.

Az elméletet később A.J. Ariens és R.P. Stephenson fejlesztette tovább a belső (intrinszik) aktivitás definiálásával. Az elmélet szerint

(1) Az agonisták azok a gyógyszerek, melyek kötődni tudnak a receptorhoz, és azt aktiválni is képesek (ún. belső (intrinszik) aktivitással rendelkeznek);

(2) A belső (intrinszik) aktivitás a receptorral kölcsönhatást kialakító gyógyszermolekula biológiai hatást kiváltó képessége; míg

(3) Az antagonisták a receptorral kölcsönhatásba lépő (termodinamikai affinitással rendelkező), de biológiai választ nem indukáló (belső (intrinszik) aktivitással nem rendelkező) vegyületek.

A belső (intrinszik) aktivitás bevezetésével értelmezhetővé váltak azok a kísérleti eredmények, melyek azt mutatták, hogy azonos termodinamikai aktivitással (K_D értékkel) bíró agonisták biológiai válaszreakciói különbözőségeket mutattak. Az belső (intrinszik) aktivitást a dózis-válasz görbe magassága határozza meg.

A dózis-válasz görbe kvantitatív értelmezésének egy az előző – elsősorban az ligandum-aktivált ioncsatornák vizsgálata alapján kimunkált – elméletétől különböző elméletének alapja D.E. Koshland Jr. ún. indukált illeszkedési (induced-fit) elmélete, melyet a szerzők (D.E. Koshland Jr., G. Némethy és D. Filmer) az enzimkatalizált reakciók molekuláris mechanizmusának értelmezésére dolgozott ki (KNF modell). Az elmélet szerint az enzim kötőhelyének konformációja flexibilis. A szubsztrát kötődése az enzim kötőhelyének konformáció-változását eredményezi, ami így alkalmas válik a katalitikus funkciójának betöltésére. Az elmélet alapján a biológiai hatás kialakulásának feltétele - az enzim-szubsztrát komplex kialakulása mellett - az enzimfehérje konformáció változása.

A szubsztrát kötődik az enzimhez és a hatás kialakulásához szükséges konformáció-változást eredményezi

Az antagonista kötődik az enzimhez, de a kötődés nem indukálja a hatás kialakulásához szükséges konformáció-változást.
A gyógyszer-receptor kölcsönhatás és azt annak eredményeképpen megfigyelhető biológiai válasz kialakulásának egyik következő elmélete W.D.M. Paton munkásságának eredménye. Paton ún. kinetikus elmélete szerint (1967) az időegység alatt aktuálisan kialakuló gyógyszer-receptor kölcsönhatások száma (képződésük sebessége) egyenesen arányos a biológiai hatás mértékével (erősségével). Az elmélet szerint

(1) Az agonisták gyorsan asszociálódó és gyorsan disszociáló;

(2) A részleges (parciális) agonisták közepes sebességgel asszociáló és közepes sebességgel disszociáló, míg

(3) Az antagonisták gyorsan asszociáló, de lassan disszociáló vegyületek.

A dózis-válasz görbék gyógyszer-receptor kölcsönhatások alapján történő értelmezésének egy következő példája az ún. makromolekuláris pertubáció elmélete. Az elmélet alapja az a feltételezés, hogy a ligandum-receptor kapcsolat kialakulásának eredményeképpen kéttípusú (specifikus és nemspecifikus) pertubáció következhet be a makromolekula szerkezében. A biológiai hatás intenzitását a hatást eredményező - a hatás szempontjából optimális konformációjú - gyógyszer-receptor komplexek képződésének sebessége határozza meg. Az elmélet alapján:

(1) Az agonisták a receptor (celluláris makromolekula) megfelelő konformációs változását eredményezi, míg

(2) Az antagonisták a receptor (celluláris makromolekula) megfelelő konformációs változása hiányában nem eredményeznek választ (hatást).
A makromolekuláris pertubáció elméletének kiterjesztése az ún. alloszterikus elmélet (Monod-Wyman-Changeux modell (MWC modell). Az MWC modell kimunkálóinak – J. Monod, J. Wyman, és J.-P. Changeux – feltételezése szerint a szabályozott fehérjék, így az enzimek és receptorok, regulátor-molekulák távollétében különböző, egymásba átalakítható állapotban (konformációban) léteznek. A különböző konformerek arányát a termikus egyensúlyokra érvényes összefüggések adják meg. Az eredeti modell leírásakor használt jelöléseket használva, minden fehérje, fehérje alegység, regulátor molekulák távollétében két kitüntetett konformációval – R (Relaxált)-aktív és T (feszült)-inaktív – rendelkezik. A ligandum (L) mindkét konformációhoz kötődhet, különböző erőséggel. A termodinamikailag kevésbé stabilis R konformáció ligandum-kötő képessége (affinitása) nagyobb. Így, a ligandum kötődése a fehérjéhez – a tömeghatás törvénye alapján – megnöveli az R konformer részesedését az egyensúlyi elegyben. Az elmélet szerint

(1) Az agonisták az R (aktív) formához kötődnek erősebben (képeznek stabilisabb komplexet) és így a hatékony konformer részesedését növelik meg;

(2) A parciális agonisták mindkét formával összemérhető stabilitású komplexet alkotnak; míg

(3) Az antagonisták az inaktív T formához kötődnek erősebben, és növelik meg annak részesedését a konformer-populációban.

Mai ismereteink szerint a ligandumok szelektálnak a fehérjék eleve létező konformációi között, az MWC modellnek megfelelően. Az oligomer oldalláncai pedig illeszkednek a kötődő ligandumhoz, a KNF modellel összhangban. Vagyis az MWC és KNF modellek antitézise szintézis felé közeledik.