Masarykova univerzita

14.Příprava a zpracování environmentálních vzorků

Kontaminované vzorky BCHL obvykle obsahují více komponent, které jsou nejlépe charakterizovány následnou chromatografickou separací. Tyto vzorky obvykle spadají do jedné z následujících základních kategorií;

1. 
   munice nebo muniční fragmenty
   
2. 
   environmentální (např. vzorky půdy, vody, vegetace nebo vzduchu)
   
3. 
   uměle vytvořené materiály
   
4. 
   biologická média (např. krev nebo moč) [5]
   

Použitý analytický postup závisí na množství analyzovaného vzorku, které je nutné získat pro přípravu finálního vzorku nebo extraktu pro chromatografickou analýzu. Environmentální a další vzorky obvykle vyžadují extrakční rozpouštědlo a zakoncentrování před analýzou [5].

15. Instrumentální metody pro stanovení BCHL a jejich simulantů

Pro posouzení úrovně kontaminace/dekontaminace, transportu a osudu BCHL v prostředí je nezbytné mít k dispozici analytické postupy umožňující srovnávat výsledky získané pomocí simulantů BCHL s výsledky interakcí s BCHL, které se provádí pouze ve specializovaných laboratořích [5].

HRMAS NMR metoda, byla použita proto, že umožňuje identifikovat výchozí látky a produkty, ať už jsou těkavé nebo stálé. HRMAS NMR byla použita pro analýzu materiálů obohacených čistou látkou nebo zředěnými roztoky. HRMAS NMR detekce je však omezena detekčním limitem NMR, který není tak nízký, jako u techniky GC-MS nebo LC-MS [5, 23].

Kromě toho, HRMAS přístroje jsou poměrně velké a drahé a vyžadují kryogenní a další nákladnou údržbu. Použití GC plynové chromatografie s různými detektory včetně hmotnostní spektrometrie (MS) je výhodnější především pro těkavé látky, navíc je zařízení levnější a dnes již standardní výbavou většiny analytických laboratoří. V poslední době se začínají uplatňovat i metody LC-MS pro jejich schopnost analyzovat velmi nízké koncentrace polárních látek a látek méně těkavých. Syntetické nebo relativně čisté vzorky nevyžadují chromatografickou separaci, jsou také často charakterizovány nukleární magnetickou rezonancí (NMR), nebo také infračervenou spektrometrií s Fourierovou transformací (FTIR) [5, 23].

Inspektorát OPCW, koncový uživatel analytické techniky pro BCHL, vyžaduje použití dvou a více spektrometrických technik a dostupnost autentických referenčních standardů pro jednoznačnou identifikaci kontrolovaných sloučenin. Z tohoto důvodu je zvýšená pozornost věnována kombinovaným metodám, např. použití GC-FTIR, které umožní snížení detekčních limitů blížící se například GC-MS analýze. Pro analýzy nízkých koncentrací BCHL v přítomnosti vysoké hladiny interferentů je uplatňována tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS) [5].

7. Chromatografické metody

Nejčastěji používaná analytická separační metoda pro screening kontaminovaných vzorků bojovými chemickými látkami je plynová chromatografie s kapilárními kolonami. Nejlepších výsledků bylo dosaženo s mírně polárními stacionárními fázemi jako je (86%)-dimethyl-(14%)-kyanopropylfenyl-polysiloxan. Chirální stacionární fáze byly vyvinuty pro analýzu stereoizomerů z několika chirálních nervových látek, především somanu. Pro analýzu BCHL bylo také úspěšně využito více kolon s různými polaritami během jedné analýzy. Autoři používají pro takovou metodu termín „retenční spektrometrie“. Většina z GC detektorů může být použita k analýze vzorků BCHL s detekčními limity v rozsahu nanogramů až pikogramů na nástřik. Pro předběžné analýzy je běžně používán plamenový ionizační detektor (FID). Obrázek 2 znázorňuje typickou GC-FID chromatografickou separaci získanou pro 3 druhy yperitu, oxolový yperit HT, HS a seskviyperit HQ, z nichž každý obsahuje yperit a řadu delších řetězců zpuchýřujících látek. Potřeba větší specifity a citlivosti analýz vedla k použití specifických prvkových detektorů, jako jsou plamenový fotometrický detektor (FPD), thermoionizační detektor (TID), atomový emisní detektor (AED) a detektor elektronového záchytu (ECD). Současné použití FID s jednoprvkovými nebo víceprvkovými specifickými detektory může být demonstrováno během dvou nebo tří-programové GC analýzy pomocí konvenční a termální desorpce zavedeného vzorku [5].

Data získaná pomocí více detektorů mohou poskytnout velmi dobrý důkaz o přítomnosti BCHL, ale nemohou být použity k plnému potvrzení. Pro potvrzení přítomnosti BCHL je nezbytné použití GC s jednou nebo více spektrometrickými technikami jako je MS nebo FTIR [5].

Obr.

. 2; Chromatogramy GC-FID tří druhů yperitu HT, HS, HQ. GC podmínky: 15 m x 0,32 mm ID J&W DB-1; 50°C (2 min) 10 °C/min 280 °C (5 min)). Identifikované sloučeniny – 1. 1,4-thioxan, 2. 1,4-dithian, 3. yperit (H), 4. bis(2-chlorethyl)disulfid, 5. 2-chlorethyl (2-chlorethoxy)ethyl sulfid, 6. Seskviyperit (Q), 7. bis(2-chlorethylthioethyl)eter (T), 8. 1,14-dichlor-3,9-dithia-6,12-dioxaheptadekan, 9. 1,14-dichlor-3,6,12-trithia-9-oxatetra-dekan, 10. 1,16-dichlor-3,9,15-trithia-6,12-dioxaheptadekan [5]

Nervové a zpuchýřující látky podléhají v prostředí hydrolýze. V rámci Úmluvy o chemických zbraních jsou vyžadovány metody pro retrospektivní detekci a potvrzení výchozích látek a produktů hydrolýzy. Analýza těchto sloučenin je důležitá, protože by neměly být běžně detekovány v přírodních vzorcích a jejich identifikace silně naznačuje předchozí přítomnost BCHL. Degradační produkty BCHL, zejména nervových látek, nejsou těkavé produkty a musí být derivatizovány před GC analýzou [5].

Rozmanitost derivatizačních činidel vedoucích ke vzniku pentafluorobenzylu, methylu, terc-butyldimethylsilylu a trimethylsilyl eterů (nebo esterů) umožňuje GC analýzu organofosforových kyselin souvisejících s nervovými látkami (alkyl methylfosfonové kyseliny a methylfosfonové kyseliny). Stále častěji se používá kapalinová chromatografie-elektrosprej-hmotnostní spektrometrie (LC-ESI-MS). Data z LC-ESI-MS mohou být použita k identifikaci BCHL, jejich degradačních produktů a příbuzných sloučenin ve vodních vzorcích nebo extraktech bez potřeby dalšího nakládání se vzorky a derivatizačních kroků [5].

8. Hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrometrie je výběrová metoda pro detekci a charakterizaci BCHL, jejich prekurzorů, degradačních produktů a příbuzných sloučenin. Většina dat z hmotnostní spektrometrie byla získána na základě elektronové ionizace (EI). Mnoho BCHL, hlavně organofosforové nervové látky a zpuchýřující látky s delším řetězcem podobné yperitu neposkytují elektronovou ionizací informace o molekulárním iontu. To znemožňuje bezchybné potvrzení těchto BCHL. Výsledkem může být identifikace jiných BCHL nebo souvisejících nečistot. Z tohoto důvodu bylo značné úsilí věnováno použití chemické ionizaci (CI) jako doplňující ionizační technice. Tato mírnější forma ionizace obecně poskytuje informace o molekulárním iontu BCHL a je používána pro identifikaci příbuzných sloučenin a nečistot v muničních vzorcích a extraktech BCHL z environmentálních vzorků. Charakterizace těchto příbuzných látek je důležitá pro alternativní analýzy a mohou poskytnout také informace o původu vzorku, použitém syntetickém procesu nebo stupni degradace (zvětrávání). Methan, isobutan a ethylenové plyny byly použity pro CI a získání informací o molekulárním iontu organofosforových nervových látek. Byla prokázána také vhodnost amoniaku pro chemickou ionizaci organofosforových nervových látek a příbuzných sloučenin [5].

Chemická ionizace s reakčním plynem poskytuje nejen data o molekulárním iontu, ale také vysoký stupeň specifičnosti, pokud nejsou základní složky vzorku ionizovány amonným iontem. Pro plné potvrzení by měla být porovnána získaná EI a CI data hmotnostní spektrometrie s původními referenčními daty. GC-MS/MS umožňuje specifickou a citlivou detekci BCHL a výrazně snižuje šum spojený s  extrahovanými látkami z biologických a environmentálních vzorků. Techniky kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí LC-MS používající ionizaci elektrosprejem (ESI) a chemickou ionizaci za atmosférického tlaku APCI umožňují identifikaci produktů hydrolýzy bojových chemických látek. LC-ESI-MS metody byly použity pro přímou analýzu produktů hydrolýzy BCHL v řadě studií a s výhodou použity pro analýzu nervových látek. Tyto instrumentální metody doplňují nebo i nahrazují stávající GC-MS, například v případě již zmíněné analýzy produktů hydrolýzy BCHL a kontaminovaných povrchových vod. Na obrázku 3 je uveden jako příklad LC-ESI-MS chromatogram získaný pro vodné extrakty vzorku půdy z bývalého úložiště yperitu. Yperit a zpuchýřující látky s delším řetězcem hydrolyzují na odpovídající dioly. Značné úsilí bylo vynaloženo na vývoj přenosných MS a GC-MS nástrojů, tato technika je největším příslibem pro potvrzení chemických bojových látek v terénních situacích. Alternativně mohou být odebírány vzorky ze vzduchu mikroextrakcí na pevnou fázi (SPME), na vlákna nebo na trubky Tenax. Extrahované látky jsou poté tepelně desorbovány do mobilní GC-MS. Pro detekci chemických bojových látek a jejich produktů hydrolýzy na listech, v půdě a na betonových površích byla použita hmotnostní spektrometrie sekundárních iontů. K identifikaci bojových chemických látek byla použita i spektrometrie iontových mobilit (IMS)-MS s ESI ionizací. IMS je používána ve vojenských zařízeních pro rychlou detekci v terénu [5].

Obr. č. 3a) LC-ESI-MS chromatogram – vodný extrakt vzorku půdy, kde byl nalezen yperit. 3b) MS spektrum thiodiglykolu, 3c) MS spektrum 6-oxa-3,9-dithia-1,11-undekandiolu. Kolona C₁₈, 150 mm x 0,32 mm i.d. Mobilní fáze: acetonitril/voda [5]

9. Detekční trubičky

Detekční trubičky (nebo také detekční trubice, průkazníkové trubičky, trubičkové detektory apod.) slouží k provádění jednoduchých analytických testů v polních podmínkách. Požadavky na detekční trubičky jsou selektivita, rozsah analýzy, způsob použití a vyhodnocení, způsob aplikace činidel, obsah pomocné vrstvy a stav určované látky (plyn, pára, aerosoly). Detekční trubičky jsou zpravidla skleněné zatavené trubice naplněné sorbentem jako nosičem, na kterém probíhají reakce s chemickými činidly. Jako nosič bývá nejčastěji používán silikagel, ale i drcené sklo, porcelán, pemza nebo křemelina a různé moderní syntetické materiály. Chemická činidla mohou být imobilizována na nosiči nebo mohou být vpravena do trubičky, obvykle ve formě roztoku, v zatavené ampulce. Kontrolovaný vzduch je do trubičky uváděn ruční nebo elektrickou pumpou, ale také vdechovací komorou ochranné masky. Přítomnost BCHL ve vzduchu je indikována změnou zabarvení nosiče. Koncentrace BCHL se určuje obvykle podle intenzity zabarvení trubičky. V civilní praxi se používají detekční trubičky založené na vyhodnocení délky vzniklé barevné zóny. Použití trubiček je rozmanité, mohou sloužit ke kontrole ovzduší, terénu, různých materiálů a jejich povrchů, ale také ke kontrole kontaminace vody a jiných kapalin. Konstrukce trubiček umožňuje okamžité zjištění přítomnosti toxických látek, ale i jejich monitorování po dobu až několika hodin v kontinuálním i diskontinuálním režimu [30].

1. Požadavky na detekční trubičky

Vybraná analytická reakce probíhající v trubičkách musí být doprovázena zřetelnou vizuální změnou, a proto se s výhodou využívají právě barevné reakce. Sama barevná změna by měla být postřehnutelná i za zhoršené viditelnosti, případně v noci při umělém osvětlení. Vybraná analytická reakce probíhající v trubičkách musí být doprovázena zřetelnou vizuální změnou, a proto se s výhodou využívají právě barevné reakce. Sama barevná změna by měla být postřehnutelná i za zhoršené viditelnosti, případně v noci při umělém osvětlení. Obecně lze použít neutralizační reakce spojené se změnou zabarvení vhodných acidobazických indikátorů s ostrým přechodem, oxidačně-redukční reakce, srážecí reakce, komplexotvorné reakce a některé další reakce organických činidel a analytů (diazotace a kopulace, kondenzace, adice apod.). Speciálním případem je využití cholinesterazové enzymové reakce, jejímž produktem jsou kyseliny, thioly nebo jiné látky. Pokud nejsou tyto látky samy zbarveny, jsou detekovány barevnými reakcemi [30].

Použité reakce musí probíhat rychle a umožnit dosažení detekčního limitu, který by měl být nižší než je prahová toxická koncentrace dané BCHL, za dobu expozice delší než je čas potřebný k vlastní detekci trubičkou. Reakce používané v detekčních trubičkách musí být co nejméně závislé na teplotě a vlhkosti [30].

2. Trubička pro detekci nervově paralytických látek

Trubička používaná Armádou ČR od poloviny 90. let obsahuje dvě vrstvy, indikační a porovnávací a dvě ampulky naplněné tlumivým roztokem o pH 8 s přídavkem ethanolu. Indikační vrstva obsahuje bílou granulovanou celulózu s imobilizovanou a stabilizovanou acetylcholinesterázou, která je izolována z mozkové tkáně (Sus scrofa f. domestica). Jako etalon slouží vrstva žlutého drceného skla, které obsahuje nanesený substrát (acetylthio)cholin jodid a chromogenní činidlo, kyselinu 5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoovou). Principem detekce je inhibice acetylcholinesterázy, která urychluje hydrolýzu substrátu. Pokud není ve vzorku přítomna nervová paralytická látka, objevuje se na indikační vrstvě žluté zabarvení jako výsledek reakce mezi hydrolyticky uvolněným thiocholinem a Ellmanovým činidlem. V opačném případě se toto zbarvení neobjeví, nebo se objeví výrazně později (kinetická metoda) [30]. Reakční schéma je uvedeno na obr. 4.

Obr. č. 4; Hydrolýza substrátu a reakce thiocholinu s Ellmanovým činidlem [30]

V některých případech (např. při rozlišení látek G a V) mohou být užitečné i klasické chemické metody. V tomto ohledu nejlepší výsledky poskytuje tradiční aminoperoxidová metoda pro detekci látek typu G. Principem je reakce látek typu G s peroxidem vodíku za vzniku peroxykyselin, jež oxidují redoxní indikátory na odpovídající barevné produkty. Na výrobu se používá neškodný a z hlediska detekce stejně vhodný N,N,N’,N’-tetramethylbenzidin, na rozdíl od karcinogenních látek, které byly používány dříve [30].

3. Trubička pro detekci sulfidického yperitu

Vědci zjistili, že podstatou reakce není tvorba komplexu s těžkým kovem, jak bylo využíváno v minulosti. Nahrazením chloridu nebo bromidu rtuťnatého v receptuře chloristanem hořečnatým je indikační efekt zachován. Reakce sirného yperitu s Mg(ClO₄)₂ a 4,4’-bis(diethylamino)benzofenonem v prostředí ethanolu je přibližně stejně citlivá jako původní varianta s rtuťnatou solí, poskytuje jasně červené zabarvení a je odolná i vůči působení H₂S, AsH₃, PH₃, NO_x, dýmu chloridu kovu a slunečního světla. Zkrátit reakční dobu a snížit detekční limit lze ohřevem trubičky [30]. Reakční schéma je uvedeno na obr. 5.



Obr. č. 5; Reakce yperitu s 4(4’- nitrobenzyl)pyridinem[30]