Masarykova univerzita

16.Vliv matrice

Kapalinová chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) a ionizací elektrosprejem je vysoce specifická a citlivá analytická metoda, která se stala průmyslovým standardem pro kvantifikaci léčiv, metabolitů a endogenních látek v biologické matrici (např. plazmě). Tato technika je široce používána díky své schopnosti přesně kvantifikovat analyt s minimálním množstvím přečištěného vzorku a rychlé separaci. I přes výhody syntézy, LC-MS/MS metoda občas narazí na problémy, které jsou způsobeny vlivem matrice. Mezi běžné matrice, se kterými se setkávají bioanalytici, patří krev, plazma, moč, žluč a vzorky tkáně. Přesné mechanismy složek matrice, které způsobují potlačení ionizace (nebo rozšíření), nejsou známy. Příprava standardů ve stejné matrici jako vzorku a použití vnitřních standardů (ISTDS), které mají podobné nebo skoro stejné chemické a chromatografické vlastnosti, minimalizují vlivy matrice. Z tohoto důvodu jsou stabilní analyty nejlepší volbou pro vnitřní standard a v mnoha případech korigují téměř všechny matriční efekty [31].

10. Kvantitativní stanovení vlivu matrice (Veličina - Matrix Effect – ME)

Analýza reálných vzorků obohacených analyty po extrakci poskytuje data pro kvantifikaci vlivu matrice. Jedna technika zahrnuje analýzu tří sad vzorků, jedna sada obsahuje analyty přidané do původního vzorku, druhá sada obsahuje analyty přidané do extrahované matrice (po extrakci vzorku) a třetí sada obsahuje analyty v mobilní fázi, rozpouštědle, nebo pufru. Všechny sady vzorků jsou připravovány s odpovídajícími koncentracemi analytů a pak se zpracovávají stejně. Tak může být kvantifikována míra zvýšení nebo snížení výsledků analýzy způsobené působením matrice [31].

Vliv matrice (matrix effect) ME (%) = B / A * 100

Recovery RE (%) = C / B * 100

A = plocha píku analytu v čistém rozpouštědle (externí kalibrace), B = plocha píku analytu přidaného do extraktu vzorku, C = plocha píku analytu přidaného před zpracováním vzorku a extrakcí do původního vzorku [31]

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

17. Použité chemikálie

Ethanol pro HPLC (99,8 %), methanol pro HPLC (99,9 %), acetonitril pro HPLC (99,9 %), dichlormethan (99,8 %), hexan (95 %), 2-chlorethyl ethyl sulfid (98 %), 2chlorethyl methyl sulfid (97 %), diethyl ethyl fosfonát (98 %), dimethyl methylfosfonát (97 %), triethylfosfonát (99,8 %), methylsalicylát (99 %), vše Sigma-Aldrich, Německo

18.Použité přístrojové vybavení

Evatherm (Labicom, ČR), ultrazvuková lázeň (Bandelin electronic), automatické pipety Eppendorf 10-100 μl, 100-1000 μl, 0,5-5 ml, 1-10 ml, analytické váhy (Mettler-Toledo AE 240, Švýcarsko), HPLC Agilent 1200 Series, hmotnostní detektor 6410 Triple Quad (Agilent Technologies, Inc., CA, USA), LC kolona ACE 3 C18 (3 μm, 250 mm x 4,6 mm, Advanced Separation Technologies, UK), centrifugy, automatický extraktor Büchi 811 (Švýcarsko).

19.Chromatografická analýza simulantů BCHL

Analýza obsahu vybraných simulantů BCHL (CEES, CEMS, DEEP, DMMP, TEP, MS) ve vzorcích získaných z dále popsaných experimentů byla uskutečněna kapalinovou chromatografií s UV(DAD) a MS detekcí. V případě simulantů BCHL, pro které byly nalezeny vhodné podmínky MS detekce s ESI ionizací (DEEP, DMMP, TEP), byly analýzy uskutečněny metodou LC-MS/MS s ESI ionizací v režimu MRM (multiple reaction monitoring). V případě ostatních tří simulantů BCHL (CEES, CEMS, MS), pro něž nebyly nalezeny vhodné podmínky ionizace žádnou z použitých ionizačních technik (ESI, APCI, APPI), byla použita UV(DAD) detekce při vlnové délce 205 nm. Chromatografická analýza byla uskutečněna v systému s reverzními fázemi (RPLC – C18). K izokratické eluci byla použita mobilní fáze acetonitril/voda v poměru 75/25 (v/v). Průtok mobilní fáze byl 0,5 ml.min^-1, teplota kolony 25 °C, objem dávkovaného vzorku 5 µl. Výsledek chromatografické analýzy (chromatogramy sledovaných analytů) jsou na obr. 6a) - c) pro UV detekci a 6d) - f) pro MS detekci.



Obr. č. 6a) CEES; chromatogram UV detekce, vlnová délka 205 nm, 10 µg.ml^-1



Obr. č. 6b) CEMS; chromatogram UV detekce, vlnová délka 205 nm, 10 µg.ml^-1



Obr. č. 6c) MS; chromatogram UV detekce, vlnová délka 205 nm, 10 µg.ml^-1



Obr. č. 6d) DEEP; chromatogram MS detekce, koncentrace 10 µg.ml^-1



Obr. č. 6e) DMMP; chromatogram MS detekce, koncentrace 10 µg.ml^-1



Obr. č. 6f) TEP; chromatogram MS detekce, koncentrace 10 µg.ml^-1

20.Srovnání způsobů ionizace pro LC-MS/MS detekci a stanovení simulantů BCHL

Všechny LC-MS/MS analýzy vzorků získaných v popsaných experimentech v kapitole 14 byly uskutečněny pomocí zařízení 6410 Triplequad firmy Agilent Technologies s MS analyzátorem typu trojitý kvadrupól, které bylo vybaveno pouze iontovým zdrojem ESI. Toto zařízení bylo použito z důvodu potřeby dosažení co nejnižších limitů detekce. Ionizace metodou ESI byla úspěšná pouze v případě látek DEEP, DMMP a TEP v pozitivním módu. Pro ověření možnosti použití jiných ionizačních technik byly uskutečněny také analýzy roztoků standardů vybraných simulantů BCHL (CEES, CEMS, DEEP, DMMP, TEP, MS) pomocí hmotnostního spektrometru 6550 QTOF s analyzátorem iontů podle doby letu firmy Agilent Technologies, které bylo vybaveno iontovými zdroji ESI, APCI i APPI. Ionizace použitými technikami byla úspěšná pouze v případě DEEP, DMMP a TEP v pozitivním módu (generace a záznam pozitivních iontů). V negativním módu ionizace a záznamu negativních iontů nebyla zaznamenána tvorba iontů v analyticky významném množství. Srovnání spekter získaných ionizací těchto látek v režimu SCAN v pozitivním módu ionizace je uvedeno na obr. č. 7-9. Spektra produktových iontů z vybraných prekurzorových iontů jsou uvedena na obr. 10. V tabulce č. 4 jsou uvedeny podmínky ionizace.

Tabulka č. 4; Podmínky ionizace simulantů BCHL v iontových zdrojích hmotnostního spektrometru

Podmínky ionizace	ESI	APCI	APPI
Teplota sušicího plynu [°C]	300	300	300
Teplota odpařovače [°C]	---	300	300
Průtok sušicího plynu [°C]	10	11	11
Tlak zamlžovacího plynu [p.s.i.]	40	40	40
Kapilární napětí [V]	4000	4000	4000
Napětí fragmentoru [V]	100	130	130
Korona [µA]	---	4	---

Obr. č. 7; Spektra iontů DEEP získaná ESI, APCI a APPI ionizací. Režim záznamu: SCAN. a) – ESI, b) – APCI, c) – APPI


a)



b)



c)

Z hmotnostních spekter iontů vznikajících ionizací DEEP použitými ionizačními technikami je zřejmé, že molekulární iont [M+H]⁺ obvykle používaný v technikách LC-MS/MS jako prekurzorový iont, v případě DEEP iont s m/z 167, vzniká pouze při ESI a APCI ionizaci. Ve spektrech ESI a APCI lze dále identifikovat iont s m/z 139 odpovídající fragmentaci [M+H-C₂H₄]⁺ a iont s m/z 111 odpovídající fragmentaci [M+H-2C₂H₄]⁺. Iont s m/z 93 registrovaný především ve spektrech APCI a APPI odpovídá pravděpodobně fragmentaci [M+H-2C₂H₄-OH]⁺. Specifický mechanismus vzniku iontů v iontovém zdroji APPI bude předmětem navazujícího studia zaměřeného na možnosti využití různých ionizačních technik v LC-MS/MS analýze simulantů BCHL.

Obr. č. 8; Spektra iontů DMMP získaná ESI, APCI a APPI ionizací. Režim záznamu: SCAN. a) – ESI, b) – APCI, c) – APPI


a)



b)



c)

Z hmotnostních spekter iontů vznikajících ionizací DMMP použitými ionizačními technikami je zřejmé, že molekulární iont [M+H]⁺ obvykle používaný v technikách LC-MS/MS jako prekurzorový iont, v případě DMMP iont s m/z 125, vzniká pouze při ESI a APCI ionizaci. Ve spektru ESI nebyl zaznamenán jiný iont, který by indikoval významnou fragmentaci již v iontovém zdroji. Ve spektru APCI lze analogicky jako u DEEP dále identifikovat iont s m/z 111 odpovídající fragmentaci [M+H-CH₃]⁺. Iont s m/z 93 registrovaný ve významné míře jen ve spektrech APCI a APPI odpovídá pravděpodobně fragmentaci [M+H-CH₃-OH]⁺.

Obr. č. 9; Spektra iontů TEP získaná ESI, APCI a APPI ionizací. Režim záznamu: SCAN. a) – ESI, b) – APCI, c) – APPI


a)



b)



c)

Z hmotnostních spekter iontů vznikajících ionizací TEP použitými ionizačními technikami je zřejmé, že molekulární iont [M+H]⁺ obvykle používaný v technikách LC-MS/MS jako prekurzorový iont, v případě TEP iont s m/z 183, vzniká pouze při ESI a APCI ionizaci. Ve spektrech ESI a APCI lze dále identifikovat iont m/z 155 odpovídající fragmentaci [M+H-C₂H₄]⁺, iont m/z 127 odpovídající fragmentaci [M+H-3C₂H₄]⁺ a iont s m/z 98 odpovídající fragmentaci [M+H-3C₂H₄]⁺. Iont s m/z 80 registrovaný ve spektru APPI odpovídá pravděpodobně fragmentaci [M+H-3C₂H₄-OH]⁺.

Z uvedených spekter vyplývá, že pro MS/MS detekci látek DEEP, DMMP a TEP v režimu MRM (multiple reaction monitoring) lze využít jako prekurzorové ionty typu [M+H]⁺ při ESI i APCI ionizaci v pozitivním módu. Součástí navazujících experimentů bude ověření možnosti využití APPI k ionizaci látek CEES, CEMS a MS využitím přídavku vhodného „dopantu“, podporujícího ionizaci v APPI technice.

Obr. č. 10; Spektra produktových iontů vznikajících z prekurzorových iontů DEEP, TEP a DMMP získaných ESI ionizací. Režim záznamu: PI (product ions)

1. 
   – DEEP, b) – TEP, c) – DMMP
   

a)



b)



c)

Z hmotnostních spekter produktových iontů vznikajících z prekurzorových iontů získaných ESI ionizací DEEP, DMMP a TEP je zřejmé, že fragmenty prekurzorových iontů [M+H]⁺ registrované již ve spektru prekurzorových iontů budou s výhodou použitelné pro MS/MS detekci v režimu MRM, v případě DEEP iont s m/z 111, v případě DMMP ionty s m/z 125 a 93 a v případě TEP ionty s m/z 127 a 99, vznikající v kolizní cele hmotnostního spektrometru podle výše navržené fragmentace.